Выделение митохондрий на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге himac CR22N производства Eppendorf AG
Митохондрии - внутриклеточные органеллы большинства эукариотических клеток, имеющие собственную ДНК. Митохондрии – энергетические станции клеток. Метод дифференцированного центрифугирования для исследования субклеточных структур, в частности митохондрий, разработал доктор Альбер Клод, получивший Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1974 году.
В данном эксперименте рассматривалось выделение митохондрий из клеток печени крыс методом центрифугирования. В процессе выделения использовались новые бакеты уникальной формы, бакетный ротор R8S, который можно применять для высокоскоростного центрифугирования с охлаждением при ускорении 11 500 х g и конические пробирки объёмом 50 мл.
Оборудование
Центрифуга: высокоскоростная центрифуга с охлаждением CR22N
Ротор: бакетный ротор R8S (на 4 пробирки)
Пробирки: 50 мл пробирки с коническим дном
Описание эксперимента
Приготовьте 10% гомогенат печени крыс (количество ткани: от 10 до 20 г)
Центрифугируйте при скорости 1 800 об/мин, ускорении 600 х g, в течение 10 минут, при +4°С, режимы ускорения/торможения – 9/9
↓Перенесите супернатант в 50 мл коническую пробирку
Центрифугируйте при скорости 5 600 об/мин, ускорении 5500 х g, в течение 20 минут, при +4°С, режимы ускорения/торможения – 9/9
↓Слейте супернатант. При декантации слегка встряхните пробирку несколько раз, чтобы избавиться от красно-коричневой липосомной фракции в верхней части осадка. Добавьте необходимое количество 0.25-тимолярного раствора сахарозы в желто-коричневый осадок митохондрий и снова центрифугируйте при скорости 5 800 об/мин, ускорении 6000 х g, в течение 15 минут, при +4°С, режимы ускорения/торможения – 9/9
Чем больше раз повторять вышеописанную операцию, тем выше степень чистоты выделенных митохондрий, однако при повторах снижается их активность, поэтому рекомендуется повторять вышеописанную операцию не более двух раз.
↓Осадок: фракция митохондрий
Количество митохондрий, полученных по описанной выше методике эквивалентно содержанию белка от 15 до 30 мг на грамм печени крысы.
Отзывы
Оставьте первый отзыв
Добавить отзыв
Добавить отзыв