Выделение геномной ДНК из растительной ткани с использованием настольных высокоскоростных микроцентрифуг himac CT15E/CT15RE производства Eppendorf AG

В этом эксперименте рассматривается получение геномной ДНК из растительной ткани с использованием набора DNeasy Plant Kit (QIAGEN) на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при использовании угловых роторов T15A61/T15A62. Выделение геномной ДНК с помощью центрифугирования имеет ряд преимуществ перед другими методами.

Оборудование

Центрифуга: настольная высокоскоростная микроцентрифуга CT15E или CT15RE

Ротор: угловой ротор T15A61 (2мл/1.5мл х 24 пробирки) или угловой ротор T15A62 (2мл/1.5 x 24 пробирки или 0.5 мл пробирки x 24)

Набор для выделения: DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)

Описание эксперимента

1. С помощью жидкого азота измельчите растительную ткань в мелкий порошок пестиком в ступке
2. Поместите порошок в 2 мл микропробирку
3. Добавьте 400 мкл буфера AP1 и 4 мкл RNease A в концентрации 100 мг/мл в пробирку и энергично встряхните
4. Инкубация при температуре +65 °С в течение 10 минут. Перемешайте 2-3 раза во время инкубации
5. Добавьте 130 мкл буфера AP2 в пробирку и перемешайте
6. Выдержите на льду в течение 5 минут
7. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 14 500 об/мин (20 000 х g) в течение 5 минут при комнатной температуре
8. Поместите QIAshredder Mini spin колонки в новые 2 мл микропробирки. Вылейте супернатант в QIAshredder Mini spin колонки. Отрежьте крышку микропробирки, содержащей колонки
9. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 14 500 об/мин (20 000×g) в течение 2 минут при комнатной температуре
10. Налейте фракцию фильтрата, пропуская через колонку, в новые 2 мл микропробирки
11. Добавьте 1,5 объема (или больше) буфера AP3/E в пробирку и осторожно перемешайте пипеткой
12. Поместите DNeasy Mini spin колонку в новую 2 мл микропробирку. Налейте 650 мкл полученного раствора в DNeasy Mini spin колонку. Отрежьте крышку микропробирки, содержащей колонки
13. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 8 000 об/мин (6 000 х g) в течение 1минуты при комнатной температуре
14. Удалите фильтрат
15. Добавьте 500 мкл буфера AW в DNeasy Mini spin колонку
16. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 8 000 об/мин (6 000 х g) в течение 1 минуты при комнатной температуре
17. Удалите фильтрат
18. Добавьте 500 мкл буфера AW в DNeasy Mini spin колонку
19. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 14 500 об/мин (20 000 х g) в течение 2 минут при комнатной температуре и осушите фильтр
20. Поместите DNeasy Mini spin колонку после описанной выше процедуры в новую 1,5 мл микропробирку и добавьте буфер AE в колонку
21. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут

22. Центрифугируйте на микроцентрифугах himac CT15E или CT15RE при 8 000 об/мин (6 000 х g) в течение 1 минуты при комнатной температуре
23. Извлеките DNeasy Mini spin колонку из пробирки. Элюат раствора геномной ДНК в пробирке следует хранить при -70°С.

Примечания:

Обязательно прочитайте инструкцию по эксплуатации ротора перед использованием.

Прочитайте инструкцию по эксплуатации набора QIAGEN для детализации протокола.

Не устанавливать скорость ротора более 10 000 об/мин (12 000 х g) при использовании 1,5 мл микропробирок с открытой крышкой при +4 °С. Крышка может оторваться под действием центробежной силы.