Экзозомы представляют собой везикулы (внеклеточные пузырьки), окруженные двуслойной липидной мембраной, их размеры колеблются в диапазоне от 50 до 150 нм. Экзосомы присутствуют в различных жидкостях организма, в том числе в плазме крови, моче, слюне, амниотической жидкости и т.п. Экзосомы имеют цитоплазматическую природу, и исследования последних лет подтверждают, что они содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Соответственно, экзосомы могут играть потенциальную роль в межклеточных взаимодействиях и/или транспорте веществ от клетки к клетке. В 2013 за исследования везикулярного транспорта была присуждена Нобелевская премия по медицине. Благодаря своим уникальным свойствам экзосомы являются значимым объектом изучения и всё чаще используются в качестве биомаркеров и в таргетной терапии.
Было показано, что для выделения экзосом высокой чистоты эффективен метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Ниже описана процедура центрифугирования в градиенте плотности OptiPrep™, обеспечивающая выделение и очистку неповреждённых экзосом.
Оборудование и условия эксперимента
Центрифуга: напольная ультрацентрифуга
himac CP100NX
Ротор: бакетный ротор P32ST
Пробирки: пробирки полиэтилентерефталатые объёмом 40 мл
Заданная скорость: 24 000 об/мин
Максимальное ускорение: 100 000 х g
Продолжительность эксперимента: 18 часов
Профили ускорения/торможения: 7/7
Заданная температура: +4
0C
Среда градиента плотности:
OptiPrep™: 60% йодиксанол в воде (1.32 г/см
3)
↓
- Смешайте 0.25M раствор сахарозы и 30 ммоль Трис-HCl и подготовьте 5, 10, 20, 40% йодиксаноловые среды.
↓
- Расположение каждого слоя в пробирке объёмом 40 мл показано ниже:
- Центрифугируйте по 2 мл начиная с верхней части пробирки, таким образом соберите 17 фракций.
Результаты
На рисунке 1 показаны результаты центрифугирования в градиенте плотности.
Экзосомы существуют при значениях плотности от 1.15 до 1.19 г/см3, соответственно, предполагается, что экзосомы будут выделены в пределах фракций №12 и №13.
Личный кабинет
