У нас юбилей!
01.04.2022
5 Основных советов для успешного проведения ПЦР в реальном времени
Независимо от того, готовитесь ли вы к своему первому эксперименту по ПЦР в реальном времени или являетесь опытным экспертом, когда дело доходит до совершенствования ПЦР-анализы в реальном времени позволяют каждому добиться максимального успеха. Проверьте свои знания в области ОТ-ПЦР и рассмотрите эти важные советы, основанные на экспертном опыте.
• Начинающий • Средний • Продвинутый • Эксперт
1. СОЗДАВАЙТЕ ОТЛИЧНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ЗОНДЫ
• Определите свой эталонный ген; отличные праймеры могут уже существовать.
• Целевой размер ампликона = 70-150 п.н.
• Охватывать соединение экзон-экзон
• Содержание ГЦ = 40-60%
• Tm = 50-65°C
• Ограничьте количество идентичных последовательностей нуклеотидов.
• Проверка специфичности с помощью Праймер-ВЗРЫВА
• Обеспечьте минимальное количество вторичных структур и предотвратите образование димер праймера.
• Оптимизируйте Ta с помощью температурного градиента на устройстве qPCR
• Используйте онлайн-инструмент, такой как PrimerQuest ® IDT, для разработки конкретных комбинаций праймера и зонда.
• Храните исходные олигонуклеотиды (100 мкМ) и разбавленные аликвоты (10–20 мкМ) в не содержащей нуклеаз H2O при температуре -20°C
2. ВЫДЕЛИТЕ ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННУЮ РНК
• РНК очень чувствительна к деградации; используйте СИЗ, убедитесь, что все инструменты и рабочая зона стерилизованы H2O2, и храните образцы на льду
• Обеспечьте высокое качество РНК (соотношение 260/280 1,8–2,0; в идеале 2,0) количество (варьируется), прежде чем приступить к синтезу кДНК
• Если вас беспокоит качество, нанесите РНК на гель; размазывание в отличие от двух чистых полос (2:1) указывает на низкое качество
• Обработайте ДНКазой для удаления загрязнений из геномной ДНК (гДНК) перед синтезом кДНК
3. УТОЧНИТЕ КОЛИЧЕСТВО ШАБЛОНОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕАКЦИИ
• Перед использованием перемешайте и быстро закрутите все реагенты, убедившись, что при необходимости используйте пипетку малого объема (например, P10).
• Последовательно разбавлять шаблонную кДНК для определения разведения, которое дает идеальный порог цикла (Ct) значения 20-30
• Проверьте эффективность реакции [10(-1/наклон)-1]*100% и R2 > 0,95 по стандартной кривой для всех пар праймеров; всегда используйте свежие растворы
• Совместная проверка мультиплексированных анализов
4. ВКЛЮЧАЙТЕ ПРАВИЛЬНЫЕ СРЕДСТВА УПРАВЛЕНИЯ
• Контроль отсутствия шаблонов (NTC) определит, присутствует ли загрязнение в вашей основной смеси.
• Положительный контроль гарантирует соблюдение условий реакции и помогает определить, работают ли ваши новые праймеры / зонды.
• Контроль отсутствия обратной транскриптазы (RT) определит, есть ли у вас Загрязнители ДНК (например, из gDNA)
• Для анализов на основе SYBR® используйте кривую плавления в конце цикла, чтобы определить, что только один продукт амплифицируется
• Внутренний положительный контроль определит наличие ингибиторов ПЦР
5. ВЫБЕРИТЕ ПОДХОДЯЩИЙМЕТОД АНАЛИЗА Ct: ПОРОГ VS РЕГРЕССИЯ
• Убедитесь, что условия циклирования верны (особенно при использовании общего устройства)
• Режим регрессионного анализа установлен по умолчанию на многих устройствах qPCR
• Для порогового анализа установите базовую уровень на два цикла раньше, чем значение Ct для наиболее обильного образца; пороговое значение должно быть установлено на фазу экспоненциального роста продукта.