У нас юбилей!
11.11.2022
Субклеточное фракционирование для вестерн-блоттинга
Вестерн-блоттинг — это метод, используемый во многих лабораториях для определения количества целевого белка в образце со сложной белковой смесью. Метод основан на разделении белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносе белков из геля на мембрану и обнаружении иммобилизованных на мембране белков с помощью антител.
Что такое «субклеточное фракционирование»?
Примером применения вестерн-блоттинга является анализ экспрессии белков в различных клеточных компартментах (цитоплазме, ядре и других органеллах).
Для этого проводится так называемое «субклеточное фракционирование», которое заключается в выделении белков и других молекул, содержащихся в различных клеточных компартментах. Для данного фракционирования используется набор буферов с различным составом солей и других реагентов, конечной целью которых является разрушение барьеров как самой клетки (плазматической мембраны), так и клеточных органелл и ядрер, последовательно извлекая содержимое этих компартментов.
Так, циклы инкубации на льду с буфером чередуются с циклами центрифугирования (400 G, 10 мин, 4°С) (рис. 1), в результате чего выделяются различные субклеточные фракции (А=цитоплазматическая фракция, В=органелл, С= ядерные белки), которые будут использоваться для вестерн-блоттинга.
Субклеточное фракционирование позволяет анализировать экспрессию белков в различных компартментах клетки с помощью вестерн-блоттинга, а для этого требуются, помимо соответствующих реагентов, циклы центрифугирования.
Во время центрифугирования необходимо избегать повышения температуры образца, поэтому необходима центрифуга с охлаждением для обеспечения стабильности температуры. Микроцентрифуга Biocen 22 R от компании Orto Alresa (Испания) имеет программу предварительного охлаждения, гарантирует поддержание температуру во время процесса центрифугирования и, для большей сохранности образца, поддерживает охлаждение после завершения процесса центрифугирования.