В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Высокочувствительный метод обнаружения соматических мутаций с низкой частотой встречаемости KRAS, BRAF, NRAS и PIK3CA при колоректальной аденокарциноме с использованием технологии iPLEX HS, на базе геномного анализатора MassARRAY

1Bobbie C. Sutton; 3Ryan T. Birse; 1Kevin Maggert; 1Tammy Ray; 1Jessica Dowd; 3Jason Kazmierczak; 1Joan Kish; 1Amobi Ezenekwe; 2Andrew Bullock; 2Zonggao Shi; 2M. Sharon Stack PhD; 3Darryl Irwin. 1South Bend Medical Foundation, South Bend, IN; 2University of Notre Dame, Harper Cancer Research Center; Notre Dame, IN; 3Agena Bioscience, San Diego, CA

ВВЕДЕНИЕ

Опираясь на основополагающих принципах национальной стратегии по борьбе с раковыми заболеваниями, в 2016 году (рекомендации Национальной Онкологической Сети США) пациентам с метастатической колоректальной аденокарциномой рекомендуется пройти тест по генотипированию опухолевой ткани на мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF.

На медицинском рынке Соединенных Штатов многими лабораториями предлагаются всевозможные тесты по генотипированию мутаций с использованием различных платформ с широким спектром аналитической чувствительности. Несмотря на значительный технологический прогресс, проблемы аналитической чувствительности по-прежнему актуальны, например, существует потребность в методы по обнаружению и идентификации соматических мутаций с низкой частотой встречаемости, особенно для образцов с низким количеством опухолевых клеток. В настоящем клиническом исследовании была произведена оценка 143 случаев заболеваний колоректальной аденокарциномой, на мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF. Нами был использован новый аналитический подход, позволяющий уменьшить сигнал дикого типа и обнаруживать низкую мутационную нагрузку, приближающуюся к 1% на базе технологии iPLEX HS для MassARRAY (Agena Bioscience, Сан-Диего, Калифорния)

МЕТОДЫ

Были исследованы архивные образцы замороженной ДНК опухолей  колоректальной аденокарциномы человека, они были генотипированы на мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF с использованием панели OncoFOCUS ™ v2.0 или v3.0 на базе платформы MassARRAY. Образцы были деидентифицированы перед исследованием. ДНК было извлечено из образцов тканей формалин-парафиновых блоков. Гистологическое заключение и диагноз был подтвержден патологоанатомом. Выделение  ДНК было осуществлено с использованием набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Boston, MA). Перед повторным тестированием все образцы оценивали на целостность ДНК с помощью панели идентификации образцов iPLEX Pro. Все образцы нормально амплифицированной ДНК были включены в работу посредством аллель специфичной панели iPLEX HS, которая включает более 34 общих мутаций по генам BRAF, EGFR, KRAS, NRAS и PIK3CA, на базе геномного анализатора MassARRAY. Требования к анализируемой ДНК для панелей составляет 10-15 нг. Для обеспечения надлежащего качества данного исследования, внутренний позитивный контроль был введен во всех образцах. На рисунке 1 показаны этапы технологического процесса исследования.

Рисунок 1. Рабочий процесс анализа.

Пример пользовательского исследования на базе реагентов iPLEX HS
В реакционную смесь добавляется специально разработанный терминатор, который позволяет приглушить сигнал дикого типа в гетерогенном пуле нуклеиновых кислот. Данный подход позволяет идентифицировать и измерить частотность мутантных аллелей с низкой частотой встречаемости. Метод генетического анализа MassARRAY обеспечивает гарантированное обнаружение мутантных аллелей, с частотой встречаемости около 1%.
См рис 2.

Рисунок 2. Пример серий разведений для обнаружения мутации S492R в гене EGFR (Horizon Discovery-Boston, Cambridge MA) показаны спектральные пики мутантных аллелей (Mut) и аллелей дикого типа (WT) от 5% до 0% (мутантные аллели с низкой частотой встречаемости)

Панели серии OncoFOCUS ограничены в определении низкочастотных аллелей, что составляет 5-10% от общего пула мутантных аллелей, в то время как панель iPLEX HS способна определять мутантные алели с частотой встречаемости 1%. В настоящем исследовании мы протестировали 143 образцов колоректального рака с помощью панели iPLEX HS. Были подтверждены все предыдущие мутации при колоректальном раке в генах KRAS)n=52; 52/143=36,4%, NRAS (n=6; 6/143=4,2%), и гена BRAF (n=22; 22/143=15,4%). Благодаря использованию панели iPLEX HS нами были идентифицированы 8 новых мутаций с низкой частотой встречаемости по гену KRAS, NRAS, BRAF. Суммарная чувствительность панели увеличилась на 5,6% по сравнению с предыдущей. Ниже приведен пример спектров панелей OncoFOCUS и iPLEX HS рис 3.

Interestingly, we found that 5 of the 8 new low frequency mutations were in samples with a confirmed higher frequency mutation in another position. However, 3 of the 8 are new mutations for that would have potentially altered the findings/conclusions of the sample analysis. We were also able to identify previously undetected mutations in PIK3CA (n=26; 26/143=18.2%). 17 of the PIK3CA mutations coexisted with other driver mutations, as has been shown by other groups.

Следует отметить, что нами были обнаружены 5 из 8 новых низкочастотных мутаций, которые были в образцах с мутациями высокой частотой встречаемости в другом положении. Однако 3 из 8 являются новыми мутациями, которые могли бы потенциально внести существенное изменение в мутационный профиль/ выводы анализа выборки. Мы также смогли идентифицировать ранее неидентифицируемые мутации в PIK3CA (n = 26; 26/143 = 18,2%). 17 из мутаций PIK3CA сосуществовали с другими драйверными мутациями водителя, как было показано в других группах.

Рисунок 3: Сравнение образцов SBMF-42249, полученных с использованием панели Oncofocus ™ v3 и панели iPLEX HS. A) Спектр Oncofocus v3. Масс-пик дикого типа (WT) и мутантного аллеля (Mut красная стрелка) для KRAS-G12D. B) масс-пик iPLEX HS, мутантный аллель KRAS-G12D был четко обнаружен (красная стрелка)

Таблица 1: Здесь представлены дополнительные мутации, идентифицированные панелью iPLEX HS, и их оценка. Синим цветом выделены новые мутации гена PIK3CA. Желтым цветом выделены новые мутации гена KRAS, NRAS или BRAF, обнаруженные панелью iPLEX HS.

CONCLUSIONS 1. In this study our data indicate that lowering assay sensitivity from 5-10% to approximately 1% VAF in clinical CRC cases detected all previously identified mutations in KRAS, NRAS and BRAF, as well as 8 new mutations in these genes (5.6% increased mutation detection rate). 2. 5/8 of these mutations were in samples with a known higher frequency mutation at another position. 3. 3/8 were a totally new mutation for that sample that would have potentially altered therapeutic decisions for the patient. 4. We also detected 26 PIKC3A mutations (18.2%), of which 17 coexisted with other driver mutations in RAS or BRAF in 11.9% of CRC cases. 5. In 143 CRC cases, 36.4%, 15.4%, 4.2%, and 18.2% demonstrated a mutation in KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA, respectively.

ВЫВОДЫ 1. В этом исследовании наши данные показывают, что более высокая чувствительность, способная идентифицировать низкочастотные мутации с 5-10% до приблизительно 1%  в клинических случаях колоректального рака выявило все ранее идентифицированные мутации по генам KRAS, NRAS и BRAF, а также  позволило обнаружить 8 новых мутаций в этих генах (на 5,6 % повысилась чувствительность по низкочастотным аллелям).

2. 5/8 этих мутаций были в образцах с известной более высокой частотой мутации в других позициях.

3. 3/8 были совершенно новой мутацией для данных образцовы, эти дополнительные сведения могли бы потенциально повлиять на стратегию терапевтического лечения пациента.

4. Мы также обнаружили 26 мутаций по гену PIKC3A (18,2%), из которых 17 сосуществовали с другими драйверными мутациями в гене RAS или BRAF в 11,9% случаев колоректального рака.

5. В 143 случаях колоректального рака 36,4%, 15,4%, 4,2% и 18,2% продемонстрировали мутации по генам KRAS, BRAF, NRAS и PIK3CA, соответственно.