В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Панель LungCarta для профилирования мутаций, связанных с немелкоклеточной карциномой лёгкого, производства Agena Bioscience (США)


Обзор

Система времяпролетной масс-спектрометрии MassARRAY 4 компании Agena Bioscience позволяет осуществлять высокочувствительное и быстрое профилирование соматических мутаций в образцах тканей немелкоклеточной карциномы лёгкого. Использования панели LungCarta для исследования образцов обеспечивает продуктивный скрининг по 214 мутациям в 26 опухолевых супрессорах и онкогенах. Авторы осуществили сравнительную оценку панели LungCarta с общеизвестными стандартами, такими как клеточная линия NCI-60 и фиксированные формалином и залитые парафином образцы тканей лёгочной аденокарциномы, результатом этой оценки является подтверждение надёжности и точности новой панели для обнаружения мутаций.

Актуальность дальнейших клинических исследований немелкоклеточной карциномы легкого

Рак лёгких – одна из основных причин смертельных исходов при раковых заболеваниях. Каждый год от этого вида рака умирает более одного миллиона человек и диагностируется примерно 1,2 миллиона новых случаев. 1 Прогнозы весьма не утешительны, потому что заболевание часто диагностируется поздно, когда эффективное лечение уже невозможно. За последнее десятилетие были приложены значительные усилия в области клинических исследований и разработки лекарственных средств с изученными факторами риска. Разрабатываются методы адресной терапии и способов прогнозирования течения немелкоклеточного рака лёгких. Систематический анализ позволил выявить мутации в пределах домена тирозинкиназы в генах рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) у пациентов, которые никогда не курили. 2 Больные с мутациями такого рода довольно восприимчивы к лекарственным препаратам - ингибиторам тирозинкиназы, таким как гефитиниб (70%) и эрлотиниб (80%). Тем не менее, уровень восприимчивости варьируется, и в ходе лечения многие из таких пациентов снижают уровень восприимчивость к лекарствам при средней продолжительности жизни до пяти лет. В другом опубликованном исследовании отмечается существенная разница в частоте возникновения мутаций в рецепторе эпидермального фактора роста и уровнем восприимчивости к гефитинибу между пациентами-японцами и американцами, инициируя появление вопросов и вариациях молекулярного партеногенеза рака 3. Устойчивость к ингибиторам тирозинкиназы отмечается у курильщиков вследствие частого присутствия мутации в гене KRAS (ген вируса саркомы крыс Кирстена). В настоящее время нет медикаментозных средств для лечения KRAS-положительных пациентов. Дальнейшее понимание молекулярных основ онкогенеза, опухолевой прогрессии и реакции на медикаментозную терапию необходимо для повышения эффективности существующих на сегодня ингибиторов тирозинкиназы и для появления новых методов лечения приобретенной невосприимчивости к медикаментам и, в конечном итоге, для повышения эффективности лечения пациентов.

Обнаружение новых мишеней - молекулярных основ немелкоклеточной карциномы лёгкого и необходимость последующего подтверждения полученных данных

Для дальнейшего выяснения генетических основ рака лёгкого было проведено полномасштабное генетическое секвенирование примерно 600 генов-кандидатов, состоящих как из известных онкогенов и генов-супрессоров, так из участков семейства протеинкиназ, и генов из областей с изменяющимся числом копий. Было обнаружено более одной тысячи несинонимичных мутаций в 26 онкогенах, составляющих наиболее значимую группу лёгочной аденокарциномы. 4 Сравнение обнаруженных мутаций с имеющимися базами данных COSMIC и OMIN позволило определить, что более 800 мутаций обнаружены впервые. Многие мутации требуют дальнейшего подтверждения, опирающегося на дополнительные образцы тканей пациентов. Например, вновь обнаруженные мутации могут быть использованы для стратификации пациентов, чтобы понять и оценить полезность их участия в первой, второй или третьей фазе клинических испытаний в процессе разработки линейки фармакологических препаратов. В то время как эти мутации могут быть секвенированы, полногеномный анализ очень дорог и включает в себя весьма сложный анализ данных. Целевое секвенирование генов также нерентабельно для подтверждения генов с мутациями, этот способ больше подходит для первичного обнаружения. 5 Традиционные методы, такие как секвенирование по Сэнгеру, не могут обеспечить уровень чувствительности, подходящий для обнаружения низкочастотных соматических мутаций (5-10%). Экономически-выгодный метод должен совмещать чувствительность и высокую пропускную способность.

Панель LungCarta –специализированная панель для быстрого подтверждения

Компания Sequenom предлагает панель LungCarta, которая включает в себя 214 соматические мутации в 26 опухолевых супрессорах и онкогенах. Панель LungCarta разрабатывалась с помощью огромного банка данных мутаций, которые были выявлены в результате полногеномного скринингового исследования, и выделения среди них именно тех мутаций, которые наиболее интересны и актуальны для проведения клинических исследований.

Критерием отбора мутаций послужила частота дискретизации в соответствии с базой данных COSMIC (например, > 1% частоты встречаемости в образцах для данной мутации). Хорошо описаны как гены с высокой мутационной частотой (EGFR, KRAS, TP53), как и вновь обнаруженные онкогены, которые были также включены для более тщательного исследования в многочисленных образцах (MAP2K1 (CDKN2A), EPHA3, NTRKs, STK11 и др.) Для получения полного списка мутаций, посетите сайт www.sequenom.com

Верификация анализов панели LungCarta

Отчет по базе клеточных линий NCI-60: NCI-60 представляет собой набор из 59 человеческих раковых линий клеток, полученных из разнообразных тканей, в том числе из легких, мозга, крови, костного мозга, молочной железы, толстой кишки, почек, яичников, простаты и кожи. Клеточные линии были подвергнуты многим экспериментам и введены в базу данных COSMIC [Wellcome Trust Sanger Institute]. Компания Sequenom получила доступ к 38 клеточным линиям из базы NCI-60 и проверила их ещё раз с помощью панели LungCarta. Панель LungCarta определила 44 мутации в 38 клеточных линиях, из которых 36 мутаций были описаны ранее в базе данных COSMIC. Обнаруженные оставшиеся 8 мутаций прежде не были аннотированы и нуждаются в подтверждении с помощью других методов, в том числе с помощью панели OncoCarta производства Sequenom и/или онкологической панели Illumina TruSeq (табл. 1).

Таблица 1. Краткое описание недавно обнаруженных мутаций по базе клеточных линий NCI-60

Клеточная линия

Ген

Мутация

Частота мутации

Карцинома

M14+

STK11

L50_D53del

11%

Меланома

MOLT4+

MAP2K1

D67N

32%

Лейкимия

PC-3

BRAF

V600E

22%

Простата

T47D+

KRAS

G12S

10%

Молочная железа

UACC-257

KRAS

G12S

100%

Меланома


STK11

G196V

10% *

Меланома


STK11

Q37*

90%

Меланома

UO-31+

KRAS

G12S

10%

Почки

*Удалено при улучшении базового файла

Семь из восьми показанных мутаций были подтверждены ортогональным методом. Восьмая новообнаруженная мутация, STK11 G196V, была позднее определена как ложноположительная. Тем не менее, информация, полученная в ходе исследования, помогла сформировать базовый файл данных для этого анализа и улучшения производительности автоматизированного обмена данными с программным обеспечением Sequenom Typer 4.0.41+ и анализом данных LungCarta. Базовый файл, входящий в состав коммерческого продукта LungCarta, компенсирует анализы, такие как STK11 G196V, для лёгкого различения ложноположительных и истинно положительных результатов.

Таким образом, база клеточных линий NCI-60 показала достоверность обработки данных более 95% (43 верных результата, 1 ложноположительный результат) с возможностью обнаружения значительного количества новых мутаций, которые не могут быть обнаружены традиционным методом секвенирования по Сенгеру.

Фиксированные формалином и залитые парафином ткани

Под контролем сторонних экспертов была осуществлена оценка панели LungCarta по 40 опухолевым образцам фиксированных формалином и залитых парафином тканей. В 25 образцах (68%) была обнаружена двадцать одна мутация в десяти онкогенах. Во многих образцах было обнаружено более одной мутации, а в некоторых более двух.

Как и ожидалось, наиболее распространенные мутации были обнаружены в генах EGFR и KRAS. В 11 образцах панель обнаружила мутацию EGFR, которая ранее определялась секвенированием по Сенгеру (более 92% соответствия). Кроме того, в 10 образцах была обнаружена мутация KRAS. Интересно, что примерно в 80% образцов содержалась низкочастотные KRAS мутации (примерно 10%), которые не обнаруживались методом секвенирования по Сенгеру. Как и для всех KRAS мутаций, в этих конкретных образцах порог уровня определения для панели LungCarta был в пределах 10%. Для обнаружения любых возможных сдвигов в сигналах и в результатах анализов, дальнейшие исследования выполнялись по не шаблонным контрольным данным. Кроме всего вышеперечисленного, образцы подвергались клонированию с последующим повторным секвенированием. Некоторые из образцов содержали мутации с низкой частотой в генах MET, EPHA5 и/или NTRK.

Сопутствующие мутации в генах EGFR и KRAS нетипичны для легочной аденокарциномы, как было показано для 23 из 25 образцов. Два EGFR- и KRAS-положительные образца требуют дальнейшего анализа, который не является частью данного исследования по верификации. Было высказано предположение, что наличие сопутствующих мутаций способно модифицировать ответ на супрессию одиночной мишени в некоторых видах опухолей. 6 Таким образом, мутации-кандидаты, выявленные в этих образцах как сопутствующие основным мутациям в генах MET, EGFR, NOTCH1, TP53 и EGFR, могут быть интересны для оценке расширенного набора образцов в клиническом исследовании.

Методы

Панель LungCarta содержит готовый набор для высокочувствительного скринингового анализа образцов опухолевых тканей на системе времяпролетного геномного анализатора Sequenom MassARRAY (рис. 1). Панель содержит мультиплексный набор в 24 лунках, для проведения анализа необходимо не более 240 нанограмм ДНК на образец для параллельного анализа 214 мутаций. Панель работает с 96- и 384-луночным форматом.

Система времяпролетной масс-спектрометрии способна обработать от 4 до 128 образцов на 1-8 чипах в течение восьмичасового рабочего дня благодаря масштабируемой пропускной способности панели LungCarta (табл. 2).

Рисунок 1. Обзор рабочего процесса времяпролетного геномного масс-спектрометра

Таблица 2. Пропускная возможность обработки образцов панелью LungCarta

Количество чипов

96- луночный формат, количество образцов

384- луночный формат, количество образцов

1

4

16

2

8

32

4

16

64

8

32

128

Панель LungCarta включает в себя комплексное аналитическое программное обеспечение (Typer 4.0.41 или выше, только для исследований, не для диагностики), формирует отчет по онкомутациям и сигналам, по частоте мутаций, а также предоставляет доверительные оценки для каждого из исследуемых образцов.

Обсуждение

Панель Lung Carta обеспечивает высокопропускную и высокочувствительную детекцию наиболее значимых мутаций при немелкоклеточной карциноме лёгкого. Этот метод позволяет осуществлять быстрый анализ средней и большой выборки (от десятков тысяч до миллионов) клеточных линий, как свежезамороженных, так и фиксированных формалином и залитых парафином образцов тканей. Примечательно, что панель LungCarta была проверена на фиксированных формалином и залитых парафином образцах, которые, как известно, содержат деградированную ДНК, присутствующую в меньшем количестве, чем обычно считается подходящим для измерений OD 260/280.

Одним из преимуществ панели LungCarta является её способность осуществлять амплификацию малых ампликонов, менее 120 пар оснований, что также важно при работе с деградированными биоматериалами. Однако, всё ещё важно количество пригодных для амплификации копий в образах для получения лучших результатов на панели LungCarta. Компания Sequenom предлагает используемые только в исследованиях панели для идентификации образцов биоматериалов (ID) и для контроля качества анализа (QC), которые легко обнаруживает минимальный порог в 3 000 копий, соответсвующий 10 нг ДНК. Анализ, выполняемый в одном мультиплексе, обеспечивает быструю идентификацию образца, устраняя вероятность несоответствия и ошибки. Анализы для идентификации образцов (ID) и контроля качества (QC) могут быть использованы для классификации клеточных линий ДНК, образцов опухолевых тканей, которые могут быть предметом для исследования.

Заключение

Рак легких является чрезвычайно гетерогенным и более биологически сложным заболеванием, чем считалось ранее. 5 Основываясь на молекулярном профилировании, исследователи рака проводят дальнейшее генетическое профилирование опухолей, при этом важно одновременное исследование более чем одного гена в образце. Панель LungCarta обеспечивает возможность целевого экономически эффективного и быстрого анализа. Ключевые соматические мутации в ранее аннотированных генах и участках, таких как EGFR, KRAS и BRAF, могут быть быстро подтверждены в большом количестве образцов. Обнаружение и подтверждение мутационных профилей опухолевого подтипа будут дополняться другими клиническими исследованиями, такими как гистология, открывая новые направления в клиническом исследовании немелкоклеточной карциномы лёгкого.

Список литературы

1. Всемирная Организация Здравоохранения
2. Субраманиан Дж., и др: Доклад и результаты исследований разных стадий немелкоклеточной карциномы лёгкого у лиц, не курящих в течение жизни. J. Thoracic Oncology 2 (9): 827-30 (2007)
3. Паес Дж.Г. и др. EGFR мутации при раке легкого: взаимосвязь с реакцией на гефитиниб при клинической терапии. 304 Science, 1497-1500 (2004)
4. Динг Л. и др. Соматические мутации, затрагивающие основные сигнальные пути при аденокарциноме легких. Nature 455 (7216): 1069-1075 (2008)
5. Томас Р.К. и др. Высокопропускное онкогенетические мутационное профилирование рака человека. Nature Genetics. 39, 283-294 (2007)
6. МакКонаилл Л. и др.: Мутационное профилирование критических раковых генов в клинических образцах опухоли. PLOS 4 (11): e7887 (2009)

(с) Мариса Пирс, Алексей Накорчевский, Андерс Найгрен и Дэррил Ирвин



Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных