В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Генотипирование вируса гепатита B с помощью генетического анализатора MassARRAY 4


Надежный метод генотипирования вируса гепатита B с помощью масс-спектрометрии

L. Ganova-Raeva, 1 S. Ramachandran, 1 C. Honisch, 2 J. C. Forbi, 1 X. Zhai, 3 Y. Khudyakov1

1 Division of Viral Hepatitis, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia

2 Sequenom, Inc., San Diego, California

3 Jiangsu Centers for Disease Control, Jiangsu, China

Journal of Clinical Microbiology

Received 22 April 2010/Returned for modification 13 August 2010/Accepted 25 August 2010

Генотипирование вируса гепатита B (HBV) важно для отслеживания распространения инфекций HBV, прогнозирования развития заболеваний, профилактики развития болезней печени и выбора наиболее эффективной терапии. Существующие на сегодня методики генотипирования, как правило, трудоемкие и дорогостоящие, кроме того, довольно субъективны при интерпретации полученных данных. Для того что бы выбрать наиболее экономически эффективный и точный метод мы осуществили сравнительный анализ метода последовательности «золотой стандарт» и сравнительно нового метода анализа с помощью масс-спектрометра. Использовалась сыворотка, взятая у лиц (выборка 756 пациентов) с острой или хронической инфекцией гепатита. В выборке все генотипы были использованы для ПЦР-амплификации гена S. Все ампликоны были подвергнуты нуклеотид-специфичному расщеплению и последующему анализу на геномном масс-спектрометре методом матрично-лазерной десорбционно-ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Данные, полученные с помощью масс-спектрометрии, были использованы для последующей идентификации генотипов вируса гепатита B методом сравнения (in silico) с виртуальными масс-спектрограммами хорошо известных генотипов гепатита B. Данные, полученные методом масс-спектрометрии, полностью совпадали с данными метода филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей вируса гепатита B. Несмотря на то, что некоторые параметры, такие как конкордантность генетических данных тестируемых гаплотипов и сигналы ПЦР продуктов были несколько ниже, чем сигналы масс-пиков при генотипировании, в целом это не повлияло на точность идентификации. Этот новый оптимизированный метод на основе масс-спектрометрии обеспечивает быстрое и точное генотипирование HBV, автоматически создает отчеты и, следовательно, подходит для рутинного использования в диагностической практике.

Среди инфекций гепатит B остается главным виновником заболеваемости и смертности во всем мире. По современным оценкам 350 миллионов человек являются хроническими носителями этого вируса. Зарегистрировано 660 тыс. смертных случаев, обусловленных раком печени, вызванным гепатитом B. Гепатит B генетически полиморфен и классифицируется по 8 генотипам и 24 подтипам (4, 25). Генотипирование вируса гепатита B является наиважнейшим молекулярно-эпидемиологическим инструментом для мониторинга этой инфекции. В клинической практике генотипы гепатита B связаны со степенью тяжести заболевания и переходом гепатита B в хроническую форму, ответом на противовирусную терапию и риском развития рака печени (13, 19).

На сегодня наиболее точным методом генотипирования HBV является прямое дидезокси-секвенирование ДНК, амплифицированной из дискретных областей генома HBV, с последующим филогенетическим анализом этих последовательностей (10, 16, 29). Этот подход считается «золотым стандартом», при этом он является довольно трудоемким и, следовательно, не подходит для использования в повседневных рутинных мероприятиях по здравоохранению или в клинической практике. Анализ полиморфизмов длины фрагментов рестрикции (ПДФР) (11, 27) значительно упрощает идентификацию генотипа, но этот подход имеет ограниченную чувствительность. Метод Trugene, стандартизованный и в значительной степени автоматизированный анализ нуклеотидной последовательности, позволяет интерпретировать только до 86% данных (3, 24, 33). Для применения метода мультиплексной ПЦР требуется использование множества наборов праймеров (10, 23). При этом эффективность и точность анализа снижаются, если анализируемые последовательности отличаются значительной вариабельностью. ПЦР в реальном времени используется для генотипирования, хорошо подходит также и для количественной оценки вирусной нагрузки (9). Чип ДНК (30-32), основанный на технологии гибридизации, эффективно обнаруживает генотипы HBV, но существуют некоторые специфические требования: необходимо, что бы вирусная нагрузка в образце была более 1000 МЕ / мл, а её дискретность по чувствительности составляла 90% для определенных генотипов. Рассмотренный метод имеет низкую пропускную способность и является дорогостоящим, что ограничивает его широкое применение (32). Метод InnoLipa, основанный на обратной гибридизации, является одним из наиболее широко используемых в клинических лабораториях (17, 21, 26). Он точен и способен распознавать разные генотипы в образцах со смешанными  инфекциями HBV. Однако, этот метод является относительно дорогостоящим и не является открытым, что затрудняет идентификацию рекомбинантных и новых вариантов HBV.

Система MassARRAY, предназначенная для анализа нуклеиновых кислот методом времяпролетной матичной лазерной десорбционной ионизации, обеспечивает альтернативный подход для генотипирования HBV.

Система генетического анализа MassARRAY обладает способностью распознавать одиночные нуклеотидные мутации HBV. Специальный праймер затравка в сайт-специфической ПЦР был успешно применен для обнаружения более 60 мутаций устойчивости к медикаментозным препаратам в гене полимеразы HBV (16), в генотипе HBV (12, 14). Система MassARRAY MALDI-TOF MS способна обнаруживать и различать аллели дикого типа и мутантные аллели в смесях HBV, если процент встречаемости самого редкого генотипа превышает 10% (2). Эта технология является наименее дорогостоящей и наиболее удобной в использовании, поскольку она автоматизирована и уже нашла широкое применение в других областях исследований, таких как диагностика различных заболеваний, идентификация бактерий и штаммовая дискриминация, обнаружения маркеров рака. В этом исследовании авторы докладывают о разработке и оценке нового подхода к генотипированию HBV на основе системы MassARRAY.

Полный текст статьи доступен по ссылке http://jcm.asm.org/content/48/11/4161.full.




Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных