В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Использование генетического анализатора MassARRAY 4 от компании Agena Bioscience (США) для идентификации микроорганизмов


Dunneetal., Мультилокусное типирование последовательности (МТП) микроорганизма Streptococcuspneumonia с использованием масс-спектрометрии

Протокол iSEQ был использован для мультилокусного типирования семи генов домашнего хозяйства в 29 изолятах S. Pneumonia, полученные результаты подверглись сравнению с методом традиционного секвенирования. Совпадение было 99% (201 из 203 аллелей), кроме того протокол iSEQ правильно определил последовательности по 2 вариантам. Для ошибочно идентифицированных аллелей, правильный аллель рассматривался как второй по значимости аллель с наиболее верным значением, и мог быть легко идентифицирован с помощью ручного просмотра. Кроме того, были получены и затем типированы 43 изолята из смывов, взятых у детей Папуа – Новой Гвинеи. В основном были обнаружены новые типы последовательностей, которые до этого не встречались в базе данных MLST. Протокол iSEQ идентифицировал варианты новых последовательностей для 14 аллелей, которые были подтверждены традиционным секвенированием.

http://jcm.asm.org/content/early/2011/08/31/JCM.05113-11.abstract

Posthuma et al., Сравнительный анализ последовательностей на базе масс-спектрометрии для определения устойчивости гена UL97 человеческого цитомегаловируса к препарату ганцикловира

Инфицирование цитомегаловирусом человека (ЦМВ) может быть причиной тяжёлого заболевания и смерти при трансплантации солидных органов или стволовых клеток. Как правило, терапия осуществляется  препаратом ганцикловир, однако, в результате противовирусного лечения может возникнуть лекарственная резистентность, вследствие мутации в гене вирусной киназы UL97 цитомегаловируса. В этом исследовании протокол iSEQ (в данном исследовании он именуется МССАП – масс-спектрометрический сравнительный анализ последовательностей) сравнивался с методом циклического секвенирования для анализа мутаций в гене UL97 типового штамма ЦМВ в 43 клинических образцах. Два перекрывающихся ампликона были использованы для протокола iSEQ (469 и 468 п.о.), а один ампликон был использован для секвенирования. Все образцы были проанализированы в двух экземплярах. Не удалось провести амплификацию iSEQ в 40 случаях из 176, в основном причина этой неудачи кроется в низкой вирусной нагрузке в некоторых образцах. В 94,1% последовательностей прочитанных с помощью протокола iSEQ были идентичны с данными полученными с помощью метода циклического секвенирования. В 97,2%  SNP были идентифицированы обоими методами (iSEQ и циклическое секвенирование). По кривой титрования был найден порог по обнаружения мутантных последовательностей, который составляет 20% для каждого из методов. Для семи клинических образцов были обнаружены мутации, связанные с резистентностью. Кроме того, iSEQ был использован для изучения развития лекарственной устойчивости у пациента с цитомегаловирусом энцефалита. Был сделан вывод о том, что протокол iSEQ и классическое циклическое секвенирование одинаково точны. Точность обнаружения SNP в значительной степени зависит от исчерпывающих биоинформационных данных этих исходных последовательностей. В отличие от циклического секвенирования в iSEQ используется два ампликона вместо одного.

http://www.journalofclinicalvirology.com/article/S1386-6532(11)00044-8/abstract

Ganova-Raeva et al., Надежный метод генотипирования вируса гепатита B с помощью масс-спектрометрии

Генотипирование вируса гепатита B является чрезвычайно важным и необходимым мероприятием для отслеживания путей распространения инфекции. В настоящее время вирус гепатита B разделен на 8 генотипов и 24 подтипа. В этом исследовании протокол iSEQ был апробирован для генотипирования вируса гепатита B. Фрагмент S гена гепатита, состоящий из 441 п.о, был амплифицирован во «Вложенной ПЦР» (применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции). Затем последовали четыре реакции расщепления (по нуклеотидам). Были проанализированы пробы 705 случаев острого инфицирования в США и 56 случаев хронического гепатита из Африки. Все образцы были также проанализированы с помощью метода дидезокси-секвенирования. Метод iSEQ и сиквенс показали 100% согласующиеся результаты. Некорректность некоторых реакций влияет на оценку значений, но никак на точность масс-спектрометрических сигналов при генотипировании. Концентрация вируса (от E+1 до E+14) никак не повлияла на сигналы при генотипировании. Потеря свойств ампликонов была обнаружена при хранении ПЦР-реагентов при -20 в течение более 2-х месяцев. Основная задача для типирования вируса гепатита HBV, заключается в том, что в теле хозяина вирус существует в виде набора, смеси разных вариантов вируса. Тем не менее, результаты проведенных исследований показали, что гетерогенность вируса никак не влияет на точность полученных данных. Значения между 0,6 и 0,8 предполагали повышение сложности образца, по сравнению со значениями > 0.6, что является вполне достаточным для точного определения генотипа. Был сделан вывод, что этот новый тонкий метод на основе масс-спектрометрического анализа обеспечивает быстрое и точное генотипирование вируса гепатита. Производит автоматизированные отчеты по биоинформационным данным, и поэтому подходит для повседневного использования в диагностических целях.

http://jcm.asm.org/content/48/11/4161.abstract

Baylissetal., Характеристика однонуклеотидных полиморфизмов в геноме вируса JC (полиомавирус человека 2) с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии

Полиомавирусом человека 2 инфицировано 80% населения. У пациентов с ослабленным иммунитетом может быть повышена вирусная репликация. В результате развивается прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия, неизменно смертельная болезнь, смерть наступает в течение 3-4 месяцев после постановки диагноза. Из 19 образцов мочи извлекли ДНК, которая была проанализирована с использованием метода iSEQ и секвенирование по Сэнгеру, с использованием двух перекрывающихся целевых регионов (371 и 731 п.о) в гене VP1.Метод iSEQ способен успешно идентифицировать 12 образцов, включая 3 образца в которых находятся только 10 или менее инфекционных единиц в качестве исходного материала. Метод по Сэнгеру может идентифицировать только восемь образцов, причем все эти образцы должны содержать больше 20 ЕД в качестве исходного материала. По результатам, в 8 случаях анализа образцов, оба метода были схожи. Методом iSEQ были обнаружены 6 новых SNP в одном образце, 4 из 6 SNP показывали изменения в области кодонов. Оценивая полученные результаты можно заключить, что iSEQ в два раза чувствительнее традиционного секвенирования по Сенгеру и представлен как жизнеспособный, экономически более выгодный, чем секвенирование по Сэнгеру, метод для образцов с низкой вирусной нагрузкой.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19961879

SauerandKliem, Масс-спектрометрия как инструмент для классификации и идентификации бактерий

В обзоре описаны методы масс-спектрометрии в целом (MALDI, ESI и MS-MS), внимание сфокусировано на распространенном методе идентификации бактерий с использованием геномного масс-спектрометра Sequenom. Детектирование паттернов белков по массе (например, с использованием Bruker Biotyper) описывается как очень легкий, имеющий высокую экспериментальную воспроизводимость, обладающий высокими показателями успешности по идентификации, быстрый и имеющий низкую себестоимость расходных материалов. Тем не менее, протеомный масс-спектрометр совершенно не пригоден для идентификации факторов вирулентности или устойчивости к антибиотикам, а также не представляется возможным использование этого масс-спектрометра для идентификации и исследования вирусов, в силу того, что они имеют низкое содержание белка. Метод ре-секвенирования (наиболее эффективным из этих подходов, является протокол и метод iSEQ) на базе геномного анализатора Sequenom представлен как весомая альтернатива методу секвенирования MLST. iSEQ имеет высокую аналитическую чувствительность и специфичность, позволяет de novo обнаруживать изменения даже по одной паре оснований и осуществлять генетическую кластеризацию микробиологических и вирусных образцов. Открытая база данных iSEQ позволяет пользователю проконсультироваться с широким кругом справочных баз данных и произвести импорт последовательностей. Единственное ограничение заключается в том, что должна быть загружена референсная база данных об искомых микроорганизмах и вирусах, коих исследователь стремиться обнаружить в образце. Метод идентификации ПЦР-продуктов на основе электроспрейной ионизации (ESI) (система T5000 от Ibis упоминается как простой, быстрый, точный метод, с помощью стандартизованных панелей определяющий около 1400 потенциальных патогенов человека) преобразует данные базовой композиции продуктов амплификации в профиль микроорганизмов, сравнивая относительные величины с образцом.

Основным недостатком этого метода является то, что нуклеотидные последовательности не определяются (только базовый состав) и, следовательно, подход не столь информативен, в отличие от методов, где фигурируют данные по первичным последовательностям. Предполагается, что «инструментарий по масс-спектрометрии и сопутствующие процедуры (...) в ближайшем будующем будут востребованными как простые и эффективные методы в диагностике и мониторинге возбудителей».

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20010952



Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных