В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Панель для идентификации образцов Exome ID AbA производства Agena Bioscience (США)


(с) Darryl Irwin, Priscilla Hunt and Marisa Pearce

Исследования выполнены пользователями системы генетического анализа MassARRAY от компании Agena Bioscience при поддержке производителя.

Вступление

Образец может быть неправильно маркирован в месте забора материала или образцы могут перепутать в процессе транспортировки из одной лаборатории в другую. Лабораторный рабочий процесс состоит из множества сложных стадий и манипуляций, что увеличивает вероятность ошибки и ненадлежащего обращения с материалом: плохо стерилизованная пипетка, простой человеческий фактор – снижение внимания во время работы, неправильно прикрепленная метка со штрих-кодом, ошибка при внесении данных в регистрационный лист.

Было подсчитано, что около 2% образцов, хранящихся в биобанках, неправильно маркированы. По данным клеточных банков также порядка 20% клеточных линий, получаемых для хранения и последующего использования исследователями, неправильно идентифицированы. Для того, чтобы исследование было достоверным, необходимо использовать корректный образец. Возможность ошибки в исходной идентификации образца и установлении его происхождения самым непосредственным образом влияет на надежность полученных результатов и научную ценность проводимых клинических исследований.

Научно-практические и клинические исследования часто выполняются на архивных образцах, в том числе полученных в результате хирургических резекций и взятых биопсийной иглой, а также на образцах крови и плазмы. Архивные образцы обычно собирают в течение многих лет, при этом используются разные методы консервации, такие как заморозка нативных тканей, фиксация формалином и парафином. Условия хранения, включая температуру и влажность окружающей среды, могут варьироваться. Разные методы консервации и изменяющиеся условия хранения приводят к разной степени деградации образцов. Воздействие стабилизирующих реагентов может вызвать трансформацию генетического материала, например, формалин влияет на общее качество и количество нуклеиновых кислот, доступных для генетического анализа. Приведенные выше сведения подчеркивают очевидную необходимость в идентификации и проверки чистоты образцов до начала молекулярно-генетических экспериментов.

Обзор

Ниже описан процесс создания панели Exome ID AbA для использования на базе системы генетического анализатора MassARRAY. Эта панель, похожая на панель iPLEX Pro Sample ID, была разработана по заказу клиентов. Панель Exome ID AbA предназначена для анализа экзонной последовательности.

В декабре 2012 года была выпущена панель для идентификации образцов iPLEX Pro Sample ID. Данное решение обеспечивает быстрый метод сравнения образцов на предмет количественной оценки, соответствия или ошибок. Эта панель содержит 44 SNP (олигонуклеотидных полиморфизма) и 3 гендерных маркера, для количественной оценки образца и оценки качества (внутренний контроль) используется 5 копий генов. Панель представлена в одном мультиплексном формате, для анализа одного образца необходимо менее 10 нг ДНК. Панель Pro Sample ID - это высокоточный и быстрый метод для идентификации и количественной оценки геномной ДНК в образце. Метод основан на проведении ПЦР с последующим генетическим анализом методом геномной масс-спектрометрии.

В исследуемой геномной ДНК анализируются вариации по олигонуклеотидным полиморфизмам, числу копий гена, кроме этого возникает также необходимость и в анализе соответствующих образцов РНК для получения дополнительной информации о реакции на лекарственные средства, развитии заболевания и других приложений. Компания Agena Bioscience разработала панель для адресного решения этих задач. Пользовательская панель по идентификации включает в себя маркеры для идентификации в экзонной последовательности. Кроме того, в связи с особыми требованиями по максимальному количеству в пробе не поврежденной качественной ДНК, маркеры внутреннего контроля практически не затрагивают основной массив ДНК для анализа. Панель по идентификации Exome ID AbA также предоставляет информацию о молекулярном весе, генерируется информация о кривой деградации, данные по соответствию образца различным методам для последующего генетического анализа.

Дизайн эксперимента и анализ данных

Для включения маркера в панель как идентификатора образца по SNP, должны быть соблюдены следующие требования.

Основные требования:

  • Локализация SNP в экзонной области гена
  • SNP с высокой частотой минорных аллелей, > 0.4
  • Присутствие на цитогенетических массивах:
    • Illumina HumanCytoSNP-12 DNA Analysis BeadChip
    • Illumina HumanOmniExpress (Plus)
    • Affymetrix CytoScan 750K Array
    • Affymetrix CytoScan HD

Второстепенные требования:

  • Работа с системой Illumina Infinium HumanCoreExome BeadChip (26/42 SNPs)
  • Гендерные маркеры (3) локализованы в половых хромосомах X/Y, для анализа используются содержащие паралоги последовательности, в которых два паралога могут совместно амплифицироваться одной парой праймеров и затем дифференцироваться с помощью аллель специфичной ПЦР или по коротким участкам INDEL.

    Качество и количество ДНК в образце оценивается по маркерам (по пяти копиям контрольной ДНК в исследовании), используется конкурентная ПЦР с синтезированной внутренней матрицей для количественного определения абсолютного числа исходных неповрежденных темплатов. Критерием внесения маркера в панель как значимого локуса является:

  • Гены кодирующих областей должны быть использованы в качестве референтных в опубликованных онкоисследованиях.
  • Размеры экзонов должны быть достаточными для проведения амплификации - от 100-500 пар оснований, как на конкурентной ДНК, так и на анализируемой ДНК. Короткие экзоны исключаются.
  • Соматическая стабильность (по данным COSMIC, ENSEMBL и CONAN):
    • Низкий уровень зародышевой и соматической вариации по числу копий (не наблюдается как дважды удаленная)
    • Низкий уровень по полиморфизмам и соматическим мутациям (синонимичность, миссенс-мутации, нонсенс-мутации и вставки).
  • В общей сложности 42 олигонуклеотидных полиморфизма (экзоны) и 3 гендерных маркера непосредственно для идентификации образцов, а также 5 контролей числа копий ДНК для количественной оценки и оценки качества (100-500 п.о.) были амплифицированы в одной мультиплексной реакции с применением реагентов iPLEX Pro (Таблица 1).

    Таблица 1. Олигонуклеотидные полиморфизмы панели Exome ID AbA. Приведены 43 SNP (разработано по референсной последовательности (rs)), 5 число копий ДНК (Gene_ Amplicon Length), 3 гендерных маркера (AMEL, ARSD и TGIF2L).

    Контроль числа копий Albumin_100 rs12102203 rs4664475
    PPIA_200 rs12594531 rs4924
    Albumin_300 rs132655 rs495680
    PDCD2_400 rs1344 rs586421
    TBP_500 rs140679 rs6090043
    Гендерные маркеры AMEL_XY rs1657502 rs6420424
    ARSD_XY rs17548783 rs6587161
    TGIF2L_XY rs2246209 rs6977125
      rs1045728 rs2273171 rs707507
      rs10495563 rs2301771 rs7653897
      rs1065457 rs2736588 rs773901
      rs1127379 rs2889732 rs7949414
      rs1128536 rs3393 rs843364
      rs1131906 rs3737434 rs8473
      rs11356 rs3743165 rs9131
      rs11998387 rs3884596 rs9897794
      rs1200349 rs4478844  

    Для анализа биоинформационных данных и предоставления отчета по панели iPLEX Pro Sample ID применяется программное обеспечение, поставляемое вместе с системой генетического анализа MassARRAY. Для получения более подробной информации свяжитесь со службой поддержки пользователей.

    Если коротко, аналитическое программное обеспечение MassARRAY создает базу данных для простого управления результатами и последующей их интерпретации.

    • Данные по образцам сравниваются с имеющейся референсной базой данных. Быстро определяются соответствия или несоответствия значений с использованием сравнения зародышевой линии с зародышевой линией или зародышевой линии в сравнении с образцами опухолей, учитывая, что в образцах опухолей может наблюдаться потеря гетерозиготности.
    • По каждому анализируемому образцу автоматически формируется отчет, который содержит информацию о SNP профиле, идентификацию по полу и данные по количеству копий.
    • История алгоритма по сравнению с предыдущими образцами, имеющимися в базе данных.
    • Локальный алгоритм сравнения образца по отношению к другим образцам в рамках одного прогона.

    Панель Exome ID AbA включает в себя маркеры оценки качества ДНК (5), диапазон охвата неповрежденных локусов составляет 100-500 п.о. Данные о состоянии образца в виде кривой деградации/шкалы длин темплатов можно сгенерировать методом построения графика сравнения абсолютного количества неповрежденных, пригодных для амплификации темплатов и целевой длины ампликона (Рисунок 1).

    Рисунок 1. Кривые деградации/шкалы длин темплатов, полученные с помощью панели Exome ID AbA

    Кривые деградации/шкала длин темплатов, полученные с помощью панели Exome ID AbA на парафин-формалиновых фиксированных образцах. На этом рисунке изображены данные 8 образцов с различной степенью фрагментации/деградации ДНК. Ось Х - размер целевых ампликонов (пар оснований), ось Y - количество пригодных для амплификации темплатов для каждого размера целевого ампликона.

    В Таблице 2 приведены значения наклона кривых для каждого образца.

    Образец Коэффициент наклона
    FFPE_01 A08 -17.6
    FFPE_02 A11 -4.7
    FFPE_03 A12 -7.0
    FFPE_04 C11 -6.4
    FFPE_05 H09 -31.9
    FFPE_06 P12 -11.4
    FFPE_07 L08 -21.2
    FFPE_08 L11 -1.8

    Поскольку все извлеченные образцы ДНК подвержены какому-то уровню деградации, кривые деградации панели Exome ID AbA стандартизованы по отношению к средней величине деградации, которая наблюдается в ДНК 94 клеточных линий HapMap (Клеточный банк Coriell, Нью-Джерси, США). Для удовлетворений пожеланий пользователей информация по деградации контрольного (референсного) фрагмента может быть изменена. Пользователи могут использовать альтернативные справочные данные по деградации. Для перенастройки программы, пожалуйста, свяжитесь со службой поддержки клиентов.

    Образцы, имеющие кривые с положительным коэффициентом наклона, имеют более низкие уровни деградации, чем контрольный образец, тогда как образцы с отрицательной величиной коэффициента наклона имеют более высокую степень деградации, чем референсный образец. Величина наклона указывает на степень деградации. По наклону и диапазону кривой определяют соответствие качества образца определенным требованиям для использования в разных методах генетического анализа.

    Как и следовало ожидать, нуклеиновые кислоты, извлеченные из клинических парафин-формалин фиксированных образцов, показывают высокий уровень деградации из-за перекрестного сшивания и фрагментации, которые вызваны фиксацией материала формалином и парафином и условиями хранения образцов. Исследованные образцы получены при хирургических операциях и методом жидкостной биопсии, они содержат ДНК опухолевых тканей легких, толстой кишки и кожи (меланома).

    Степень деградации ДНК и количество пригодных для амплификации темплатов чрезвычайно сильно различаются от одного образца к другому, поэтому требуется точная и достоверная оценка образцов на пригодность для генетических исследований различного типа, которую можно провести с помощью панели Exome ID AbA. Все исследованные образцы имеют достаточно короткий ампликон (100 п.о.), но подходят для дальнейшего анализа соматических мутаций с помощью генетического анализатора MassARRAY. Для других технологий такая длина ампликона может оказаться недостаточной.

    Рисунок 2. Обзор рабочего процесса панели Exome ID AbA Panel. Диспенсирование - в зависимости от формата системы SpectroCHIP Array.

    Выводы

    Панель Exome ID AbA была разработана совместно пользователями и компанией Agena Bioscience для подтверждения цепочки обеспечения сохранности образцов для экзонного секвенирования и цитогенетических исследований. Эта панель использует все преимущества отчетов iPLEX Pro Sample ID и программного обеспечения системы MassARRAY. В общей сложности в панель Exome ID AbA входит 42 олигонуклеотидных полиморфизма (высокочастотные минорные аллели, расположенные в пределах экзонов), 3 гендерных маркера, также 5 маркеров оценки числа копий ДНК. Анализ клинических образцов показывает, что они заметно отличаются по количеству и качеству, что привод к риску получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов по биомаркерам. Для уменьшения такого рода рисков в панель включены маркеры контроля качества нуклеиновых кислот, охватывающих ПЦР ампликоны  размером 100-500 п.о.

    Информация о качестве ДНК представлена в виде графика, где отображается степень деградации и размер фрагментов, определяющие соответствие или несоответствие образца требованиям конкретного вида генетического анализа/манипуляции. Эти 50 анализов мультиплексируются в одной реакции SNP генотипирования. Для анализа требуется менее 10 нанограмм ДНК из образца. Метод является быстрым, точным и экономически эффективным способом для идентификации и количественной оценки образцов.



    Связаться с нами / оформить заказ

    Ваше имя *
    Организация *
    Контактный телефон
    Контактный E-mail *
    Интересующий продукт *
    Сообщение
    пожалуйста, заполните все поля со *

    CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

    При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных