В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Определение мутаций, связанных с раком толстой кишки, методом масс-спектрометрии MALDI-TOF


Быстрый, чувствительный, воспроизводимый и экономичный метод мутационного анализа рака толстой кишки и метастазов в лимфатические узлы.

Debora Fumagalli, Patrick G. Gavin, Yusuke Taniyama, Seung-II Kim, Hyun-Joo Choi, Soonmyung Paik,
Katherine L. Pogue-Geile

Обзор

Актуальность темы: Всё большее количество исследований показывает, что с помощью генетических маркеров возможно уточнение прогностических данных и прогнозирование эффекта системной терапии. Нашей целью было разработать высокопроизводительную, экономически эффективную и простую методику выявления клинически значимых мутаций в «горячих точках» ДНК клеток рака толстой кишки.

Методы: матрично-активированная десорбционная ионизационная лазерная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF) и панель OncoCarta компании Sequenom были применены для анализа 239 линий клеток рака толстой кишки и 39 метастатических лимфатических узлов из клинического испытания NSABP C-07 (образцы представляли собой парафин-формалин фиксированные ткани).

Результаты: Среди 238 наиболее частых мутаций «горячих точек» 19 генов, включённых в панель OncoCarta, в наших образцах рака толстой кишки были обнаружены мутации 7 различных генов в 26 различных нуклеотидных позициях. Двадцать четыре теста, с помощью которых мутации были обнаружены более чем в 1% образцов, были скомпонованы в новую объединённую панель, определённую здесь как ColoCarta. Мутационный анализ был повторён на 32 мутантных образцах с использованием панели ColoCarta, при этом результаты были идентичны результатам использования панели OncoCarta, что демонстрирует воспроизводимость результатов использования данной методики. Другим доказательством ценности полученных данных был тот факт, что частота наиболее распространённых мутаций рака толстой кишки была аналогичной частоте, представленной в базе данных COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer - Каталог соматических мутаций злокачественных опухолей). Частоты мутаций составили 43,5% для KRAS, 20,1% для PIK3CA и 12,1% для BRAF. Кроме того, были обнаружены нечастые мутации в NRAS, AKT1, ABL1 и MET. Мутационный анализ метастатических лимфатических узлов и соответствующих им первичных опухолей показал, что мутации в 89,7% случаев совпадают. Все мутации, найденные в лимфатических узлах, также были найдены в соответствующей первичной опухоли, однако в 4 случаях мутация присутствовала только в первичной опухоли.

Выводы: Данное исследование описывает высокопроизводительную технологию, которая может использоваться для исследования ДНК, выделенной из парафин-формалин фиксированной ткани, и определяет характерные мутации, свойственные раку толстой кишки. Развитие данной технологии и панели ColoCarta может обеспечить механизм быстрого скрининга мутаций в клинически значимых генах, таких как KRAS, PIK3CA и BRAF.

Регистрация исследования: ClinicalTrials.gov: NSABP C-07: NCT0000493

Актуальность темы

Последние данные свидетельствуют о том, что мутационный анализ может помочь в определении прогноза развития рака толстой кишки. Мутации KRAS, PIK3CA и BRAF, которые часто встречаются в опухолях толстой кишки, связаны с плохим прогнозом [1-6]. Однако полученные результаты остаются противоречивыми, поскольку другие исследования показали, что мутации этих генов не являются прогностически значимыми. Большое исследование, мета-анализ мутаций KRAS, определило, что только мутация KRASG12V является плохим прогностическим признаком; другие мутации KRAS не были связаны с ухудшением прогноза [2]. Также было показано, что мутации KRAS являются потенциальными прогностическими маркерами, поскольку опухоли с мутациями KRAS в значительной степени ассоциируются с устойчивостью к схемам терапии, основанным на антителах к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) [7-11]. В публикациях сообщалось о таком же феномене в случаях мутаций BRAF и PIK3CA, хотя данные наблюдения до настоящего времени остаются недостаточно обоснованными [12.13]. Опубликованное исследование, предполагающее устойчивость опухолей с мутацией BRAF к схемам терапии, направленным на EGFR, было небольшим [13]. Прогностическая значимость мутаций PIK3CA остаётся спорной, так как в других публикациях было показано, что эти мутации не имеют прогностической ценности [14,15]. Эти несоответствия, наряду с двумя другими факторами, ограничили применение мутационного анализа в определении прогноза в стандартной практике терапии рака толстой кишки. Для установления значимости влияния генной мутации на прогноз пациента необходим большой размер выборки. Еще одним ограничением является то, что до недавнего времени проведение таких крупных исследований со стандартными технологиями секвенирования было слишком затратным по времени и слишком дорогим для того, чтобы использоваться в практике клинических испытаний.

Кроме того, в то время как высокая частота встречаемости мутаций KRAS, BRAF и PIK3CA в клетках рака толстой кишки хорошо документирована, другие потенциально важные мутации не были проанализированы на большом количестве клинических образцов. Полное секвенирование генома небольшого количества образцов толстой кишки продемонстрировало, что соматические мутации в клетках рака представлены часто происходящими мутациями небольшого количества генов, а также редко встречающимися мутациями гораздо большего числа различных генов [16.17]. Мутации в этих редко мутирующих генах могут иметь подобное влияние или действовать совместно с мутациями KRAS, PIK3CA и BRAF.

Учитывая эти соображения, нашей целью было найти экономически эффективную и высокопроизводительную методику, которая позволила бы обнаружить частые и нечастые мутации генов раковых клеток в большом количестве образцов. Кроме того, было необходимо, чтобы методика работала с фрагментированной ДНК, выделенной из парафин-формалин фиксированных образцов тканей.

Масс-спектрометрическая технология генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов, основанная на платформе Sequenom, явилась идеальным выбором для мутационного анализа, с учетом этих нескольких критериев. Было показано, что технология работает с малым количеством фрагментированной ДНК (5 нг), а высокая способность мультиплексирования сводит к минимуму использование незаменимых клинических образцов. Кроме того, целый ряд исследований показал, что чувствительностью масс-спектрометрические методы превосходят традиционное Сэнгеровское секвенирование, а их результаты в высокой степени согласуются с Сэнгеровским секвенированием, пиросеквенированием и аллель-специфичной ПЦР [16.18.19]. Более того, компания Sequenom недавно разработала панель OncoCarta - панель онкогенов, которая позволяет проводить быстрый и параллельный анализ 238 простых и сложных мутаций 19 генов раковых клеток.

Панель OncoCarta включает тесты на наличие большинства мутаций клинически значимых генов рака толстой кишки, BRAF (99%), KRAS (98%) и PIK3CA (78%), а также дополнительно содержит тесты на другие раковые мутации в генах, продукты которых включены в те же сигнальные пути, что и продукты генов KRAS, BRAF и PIK3CA, такие как AKT1, EGFR, HRAS, NRAS, MET и другие. Частота мутаций KRAS, PIK3CA и BRAF в исследовании C-07 Национальной программы по адъювантной терапии рака молочной железы и толстой кишки (NSABP) была сходна с частотами для образцов толстой кишки, перечисленных в базе данных COSMIC. Это наблюдение является доказательством того, что данные о мутациях, полученные с помощью платформы Sequenom, точны. Наши результаты также демонстрируют, что большинство образцов рака толстой кишки имеет аберрантную сеть PIK (3) - RAS/RAF; аналогичные результаты были отмечены ранее [6].

Были выявлены мутации ABL1 и MET, ранее не определявшиеся в клетках рака толстой кишки, также был проведен скрининг 13 других генов, «горячие точки» которых не содержали мутаций. Более того, данное исследование позволило определить наиболее частые мутации рака толстой кишки с использованием панели OncoCarta, обеспечив необходимую информацию для уменьшения числа тестов с 187 до 24, что позволило создать небольшую, более специфичную и более экономичную панель, требующую меньшее количество ДНК, и, таким образом, сохраняющую драгоценные клинические образцы.

Методы

Клинические образцы и гистологическая оценка

Образцы, использованные в данном исследовании, были образцами из клинического испытания C-07 NSABP. Включение пациентов в данное испытание проводилось в период между 02/2000 и 11/2002 для сравнения режима оксалиплатин/болюс 5-FU/LV с только болюсным введением 5FU/LV у пациентов с раком толстой кишки II и III стадии после резекции [20]. Образцы ткани получали в ходе операции прежде, чем пациенты получали какое-либо лечение, и обрабатывались по стандартной методике формалином и заливались парафином. Исследование C-07 было одобрено этическим комитетом, от каждого участника было получено информированное согласие. Врач-патологоанатом классифицировал опухоли на низко-, средне- и хорошо дифференцированные, а также выделил перстневидноклеточную карциному, согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Образцы были классифицированы как муцинозные, основываясь на количестве муцина, фиксированного внутри опухоли (1 = отсутствие муцина, 2 = < 50% муцинозный объём/общий объем опухоли, 3 >= 50% муцинозный/общий объем опухоли). Только опухоли 3 степени дифференцировки (grade III) рассматривались как муцинозные карциномы, что соответствует критериям ВОЗ.

Изоляция ДНК

ДНК выделялась из парафиновых блоков опухолевой ткани, собранных от пациентов-участников клинического исследования C-07 NSABP. Парафиновые блоки опухолевой ткани разрезались, участки среза, содержащие наибольшее количество опухолевых клеток, определялись патологоанатомом и изолировались путём макродиссекции. Геномная ДНК извлекалась из 4 неокрашенных срезов толщиной 5 мкм. После попытки использования нескольких процедур экстракции от различных производителей (Machery Negel, Qiagen, Ambion), было установлено, что набор для полной изоляции нуклеиновой кислоты Ambion Recover-All™ (Applied Biosystem, Фостер Сити, Калифорния) позволял получить наилучший результат в отношении качества, количества ДНК и производительности на масс-спектрометре (данные не показаны). Извлечение производилось согласно рекомендациям производителя, с двумя исключениями: время обработки протеазами было увеличено (расщепление проводилось в течение ночи); элюирующий объём был увеличен до 150 мкл для получения максимального общего количества ДНК. После обработки в течение ночи дополнительное количество протеазы вносилось в образцы, в которых расщепление оказалось неполным. Количество ДНК измерялось флуоресцентным методом с использованием набора реактивов Quant-iT ™ Pico- Green® dsDNA (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и флуорометра InfiniteF200 (Tecan, Маннедорф, Швейцария).

В качестве положительного контроля для известных мутаций, а также с целью тестирования производительности платформы использовались аннотированные образцы ДНК клеточных линий (A2058, HS578T, HL60, MCF7, MDAMB231, NCI-H1299, NCI-H1395, UACC-893), приобретенные из американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния, США). Две линии клеток, SKBR3 и MCF-7, были выращены в культуре, клеточная масса фиксировалась в формалине, заливалась парафином, ДНК изолировалась с помощью методики, описанной для клинических образцов.

Технология Mass Spec Type Plex и панель OncoCarta

Для обнаружения мутаций были использованы платформа Sequenom и панель мутаций OncoCarta, мы следовали протоколу, предоставленному компанией Sequenom (Сан-Диего, Калифорния), с небольшими изменениями. Схема процедуры показана на рис. 1. Для стабилизации образцов ДНК и запуска ПЦР использовался механизм обработки жидкостей Tecan Evo. Количество ДНК, используемой в ПЦР, уменьшалось до 15 нг или менее. Амплификация ДНК проводилась с помощью пулов ПЦР-праймеров OncoCarta, свободные нуклеотиды инактивировались щелочной креветочной фосфатазой (SAP), далее проводилась реакция одномолекулярного секвенирования (single base extension reaction) с использованием праймеров, гибридизующихся с участком ДНК, непосредственно прилежащим к сайту мутации, и индивидуальной смеси нуклеотидов. Соли удалялись путем добавления катионообменной смолы. Мультиплексные реакции регистрировались SpectroChipII, и мутации, если таковые имелись, анализировались при помощи метода матрично-активированной десорбционной ионизационной лазерной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) на компактном масс-спектрометре (Sequenom, Сан-Диего, Калифорния).

Рисунок 1 Методика обнаружения мутаций. Геномная ДНК из образцов амплифицируется в ПЦР, в результате получаются копии как мутантных, так и аллелей дикого типа. Щелочная фосфатаза креветок удаляет избыток нуклеотидов из лунок для проб. Удлинение праймеров выполнялось с использованием терминирующих нуклеотидов A, C, T, G, каждый из которых имеет определённую массу. Эта линейная амплификация позволяет получить последовательности пропорционально аллелям, которые могут быть различены масс-спектрометрией (сепарация Maldi-Tof).

Панель OncoCarta версии 1.0 (Sequenom, Сан-Диего, Калифорния) состоит из 24 пулов пар праймеров и 24 пулов праймеров удлинения (extension primers), что позволяет обнаружить 238 мутаций в 19 генах, перечисленных в таблице 1. Каждый пул состоит из 5-9 пар праймеров в ПЦР. В панели OncoCarta были разработаны 2 типа анализов, определённых как простой и сложный. Простые анализы подразумевают один анализ, с помощью которого можно обнаружить изменения аминокислот определённого кодона. Сложные тесты требуют более одного анализа для определения изменения кодона, делеции или вставки, и, таким образом, с их помощью можно обнаружить множество различных аминокислотных замен или делеций. Примером сложного теста является KRAS_1 и KRAS_2, который исследует 2 различные нуклеотидные позиции в пределах кодона 12, и при совместном использовании позволяет определить все изменения аминокислотной последовательности кодона 12. Гораздо более сложные анализы, которые позволяют анализировать вставки и делеции внутри гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR, включены в панель OncoCarta.

Анализ данных

Анализ данных проводился с помощью программного пакета MassArray Typer Analyzer 4.0.4.20 (Sequenom), который обеспечивает визуализацию комбинаций данных, а также необработанных спектров. Мутации определялись двумя разными способами. Анализатор автоматизирует идентификацию мутантных аллелей путем сравнения отношений пиков дикого типа и пиков всех подозрительных в отношении мутаций аллелей, программа генерирует отчет онкомутаций, где детализируется информация о характерных мутациях и отношения пиков дикого и мутантного типа. Кроме того, необработанные данные экспортировались в Excel, собственный макрос был использован для дублирования анализа. Площадь под пиками позволяет количественно определить каждый аллель, и тем самым дать прямую оценку доли мутировавшего аллеля и аллеля дикого типа в образце [18].

Все мутации в отчёте мутаций Onco, также как и мутации во внутреннем отчёте, полученном с помощью программы Excel, были рассмотрены вручную тремя исследователями (DF, PGG, KPG). Пересмотр мутаций вручную был необходим для определения "настоящих" пиков мутантных аллелей, отличия их от пиков солей или других фоновых пиков. Отдельные мутации, полученные в отчёте мутаций Onco и во внутреннем отчёте, сравнивались, результаты были сопоставимыми.

Результаты

Мутации были обнаружены в контрольных ДНК из интактных образцов и образцов, подвергшихся обработке формалином и парафином.

Ранее описанные в контрольных линиях клеток мутации были обнаружены. BRAF_V600E, HRAS_G12D, NRAS_Q61L, PIK3CA_E545K, KRAS_G13D, NRAS_Q61K, EGFR1_S125L, и PIK3CA_H1047R были обнаружены в соответствующих линиях клеток (A2058, HS578T, HL60, MCF7, MDAMB231, NCI-H1299, NCI-H1395, и UACC-893 соответственно). Соответствующая мутация была найдена в MCF-7 (PIK3CA_E545K) как в ДНК из интактного образца, так и в ДНК, изолированной из образца, подвергшегося обработке формалином и парафином. ДНК из клинических образцов, контрольных клеточных линий, и линий клеток, фиксированных формалином и залитых парафином, показала одинаковую скорость удлинения праймеров и производительность на масс-спектрометре.

Доля мутантных аллелей в каждой линии клеток, определяющаяся исходя из площади под мутантным пиком на спектрах, колебалась в пределах 0.4-0.6, как и предполагалось для чистой клональной популяции с гетерозиготной мутацией. Спектры клеточной линии UACC-893 имели равные части мутантного аллеля и аллеля дикого типа (рис. 2A). Одно исключение из данного распределения среди клеточных линий было замечено в линии A2058, где были получены спектры, соответствующие двум копиям аллеля дикого типа и одной копии мутантного аллеля BRAF (рис. 2B). Три аллеля BRAF в линии A2058 соответствовали наблюдениям, согласно которым в этой клеточной линии существует 3 копии хромосомы 7 (COSMIC в базе данных анализа потери гетерозиготности и количества копий, основанном на наборе однонуклеотидных полиморфизмов) [21].

Платформа Sequenom обладала достаточной чувствительностью и позволяла получить количественные данные

Пилотные исследования продемонстрировали, что тесты работали с количеством ДНК в 1 нг (рис. 3). Фракция праймера, не подвергшегося элонгации, составила 0,09 даже когда количество вносимой ДНК составляло 1-3 нг; когда количество ДНК находилось между 3-14 нг часть праймера, не подвергшегося элонгации, была схожей, и составила 0,07. Таким образом, тесты работали наилучшим образом даже при использовании лишь 1 нг ДНК.

В клинических образцах при помощи некоторых тестов было возможным обнаружить мутации, представлявшие лишь 5% от общей площади двух пиков. Спектры на рис. 4 демонстрируют небольшой, но четкий пик ожидаемого размера, соответствующий мутации 1047R в гене PIK3CA в лимфатическом узле. Мы также смогли продемонстрировать чувствительность платформы путем выполнения эксперимента со смешиванием клеток. Мутационный анализ был выполнен с использованием ДНК линии клеток MCF-7 изолированно или в смеси с ДНК линии клеток SKBR3 в различном процентном соотношении. Клетки линии MCF-7 содержат мутацию PIK3CA, а клетки линии SKBR3 её не содержат. На рис. 5 показано, что мутация обнаруживалась, даже когда клетки линии MCF-7 составляли лишь 5 - 10% от всей ДНК, и только от 5 до 2.5% аллелей. Такая чувствительность важна для обнаружения мутации в клинических образцах злокачественной опухоли, которые обычно содержат некоторое количество нормальной ткани, разбавляющей опухолевые клетки. Это имеет особую важность при анализе лимфатических узлов, которые могут содержать минимум опухолевых клеток.

Таблица 1. Мутации, обнаруженные при помощи панели OncoCarta

ABL1-G250E

EGER-L747_E749del, A750P

KIT-P585P

ABL1-Q252H

EGER-E746_A750del

KIT-D579del

ABL1-Y253H

EGER-L747_E749del, A750P

KIT-K642E

ABL1-Y253F

EGER-L747_S752del, P753S

KIT-D816V

ABL1-E255K

EGER-E746_T751del, V ins

KIT-D816H/D816Y

ABL1-E255V

EGER-L747_S752del, Q ins

KIT-V825A

ABL1-D276G

EGER-L747_S752del, Q ins

KIT-E839K

ABL1-F311L

EGER-E746_T751del, S752D/SNP C2255T

KIT-M552L

ABL1-T315I

EGER-D770_N771>AGG/V769
_D770insASV/V769_D770insASV

KIT-Y568D

ABL1-F317L

EGER-D770_N771insG

KIT-F584S

ABL1-M351T

EGER-L747_T750del, P ins

KIT-P551_V555del

ABL1-E355G

EGER-E746_A750del

KIT-P551_V555del

ABL1-F359V

EGER-E746_T751del, I ins

KIT-Y553_Q556del

ABL1-H396R

EGER-L747_T751del

KIT-Y553_Q556del

AKT1-rs11555435

EGER-L747_T751del

KRAS-G12V/A/D/C/S/R/F

AKT1-rs11555431

EGER-E746_A750del, V ins

KRAS-G13C/S/V/D

AKT1-rs11555432

EGER-E746_A750del, V ins

KRAS-A59T

AKT1-rs12881616

EGER-S752_I759del

KRAS-Q61E/K/L/R/P/H

AKT1-rs11555433

ERBB2-L755P

MET-R970C

AKT1-rs11555436

ERBB2-G776S/G776LC

MET-T992I

AKT1-rs34409589

ERBB2-G776VC

MET-Y1230C

AKT2-S302G

ERBB2-G776VC/G776VC

MET-Y1235D

AKT2-R371 H

ERBB2-M774_A775insYVMA

MET-M1250T

BRAE-G464R

ERBB2-A775_G776insYVMA

NRAS-G12V/G12A/G12D

BRAE-G464V/G464E

ERBB2-P780_Y781insGSP

NRAS-G12C/G12R/G12S

BRAE-G466V/G466G/G466E

ERBB2-P780_Y781insGSP

NRAS-G13V/G13A/G13D

BRAE-G466R

ERBB2-S779_P780insVGS

NRAS-G13C/G13R/G13S

BRAE-F468C

FGFR1-S125L

NRAS-A18T

BRAE-G469S/E/A/V/R

FGFR1-P252T

NRAS-Q61L/Q61R/Q61P

BRAE-D594V|G

FGFR3-R248C

NRAS-Q61H

BRAE-F595L

FGFR3-S249C

NRAS-Q61E/Q61K

BRAE-G596R

FGFR3-G370C

PDGFRA-V561D

BRAE-L597S/R/Q/V

FGFR3-Y373C

PDGFRA-T674I

BRAE-T599I

FGFR3-A391E

PDGFRA-F808L

BRAE-V600E/K/R/L

FGFR3-K650Q/E

PDGFRA-D846Y

BRAE-K601N/E

FGFR3-K650T/M

PDGFRA-N870S

CDK-R24C/H

FLT3-I836del

PDGFRA-D1071N

EGER-R108K

FLT3_2

PDGFRA-D842_H845del

EGER-T263P

FLT3_3

PDGFRA-I843_D846del

EGER-A289V

FLT3-D835H/D835Y

PDGFRA-S566_E571>K

EGER-G598V

HRAS-G12V/D

PDGFRA-I843_S847>T

EGER-E709K/E709H

HRAS-G13C/R/S

PDGFRA-D842V

EGER-E709A/E709G/E709V

HRAS-G13V/D

P/K3CA-R88Q

EGER-G719S/G719C

HRAS-Q61H

P/K3CA-N345K

EGER-G719A

HRAS-Q61H/L/R/P/K

P/K3CA-C420R

EGER-M766_A767insAI

JAK2-V617F

P/K3CA-P539R

EGER-S768I

KIT-D52N

P/K3CA-E542K

EGER-V769_D770insASV

KIT-Y503_F504insAY

P/K3CA-E545K

EGER-V769_D770insCV

KIT-W557R/W557R/W557G

P/K3CA-Q546K

EGER-D770_N771>AGG/V769
_D770insASV/V769_D770insASV

KIT-V559D/V559A/V559G

P/K3CA-H701P

EGER-D770_N771insG

KIT-V559I

P/K3CA-H1047R/H1047L

EGER-N771_P772>SVDNR

KIT-V560D/V560G

P/K3CA-H1047Y

EGFR- P772_H773insV

KIT-K550_K558del

P/K3CA-G1049R

EGER-H773>NPY

KIT-K558_V560del

P/K3CA-R38H

EGER-H773_V774insNPH/H773
_V774insPH/H773_V774insH

KIT-K558_E562del

P/K3CA-C901F

EGER-V774_C775insHV

KIT-V559del

P/K3CA-M1043I/M1043I

EGER-T790 M

KIT-V559_V560del

RET-C634R

EGER-L858R

KIT-V560del

RET-C634W/Y

EGER-L861Q

KIT-Y570_L576del

RET-E632_L633del

EGER-L747_T750del, P ins/E746_A750del, T751A

KIT-E561K

RET-M918T

EGER-E746_T751del, I ins/S752_I759del

KIT-L576P

RET-A664D

Частоты мутаций C-07 в KRAS, NRAS, PIK3CA, и BRAF, обнаруженные с помощью OncoCarta и платформы Sequenom были схожи с данными, сообщавшимися ранее.

В этой предварительной оценке возможности использования платформы Sequenom для проведения широкомасштабного мутационного анализа образцов рака толстой кишки, изолированных из парафиновых блоков обработанной формалином ткани, необходимым условием было установить, что наши данные позволяют получить типичные частоты, уже полученные ранее. Таблица 2 показывает частоты мутаций, полученные в данном исследовании, а также частоты, взятые из базы данных COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer - Каталог соматических мутаций рака) [21]. Частоты в базе данных COSMIC, представленные в таблице 2, основаны только на тех мутациях, которые можно обнаружить с помощью OncoCarta. Тесты OncoCarta позволяют обнаружить 99%, 98%, и 78% из известных мутации клеток рака толстой кишки в генах BRAF, KRAS, и PIK3CA соответственно, основываясь на большом количестве образцов рака толстой кишки, просеквенированных в BRAF (n = 4628), KRAS (n = 858) и PIK3CA (n = 247). С помощью панели OncoCarta было установлено, что наиболее частыми мутациями в C-07 были мутации KRAS (43.5%), PIK3CA (20.1%), и BRAF (12.1%), данные подобны данным базы COSMIC. Мутации NRAS, будучи нечастыми, были обнаружены в кодонах 12, 13 и 61 и составляют измеримое меньшинство образцов C0-7 (3.8%). Эти данные позволяют предположить, что образцы ткани, прошедшей обработку формалином и парафином, можно исследовать с помощью вышеописанной технологии и получать при этом точные данные.

Рисунок 2 Cпектры для клеточных линий UACC-893 и A2058. Предполагаемые положения для неудлинённого праймера (НУП), а также продукты удлинения (мутантный и дикий тип (ДТ)) из анализов PIK3CA_9 и BRAF_15 в клеточных линиях UACC-893 и A2058, соответственно, показаны красной пунктирной линией. Также показана доля площадей пиков и конкретных оснований. Анализы PIK3CA_9 и BRAF_15 обнаружили мутации в PIK3CA в положении аминокислоты 1047 и в BRAF в положении аминокислоты 600, соответственно. Другие пики, включённые в эти спектры в результате мультиплексирования, но не являющиеся частью указанных анализов, указываются как серые пунктирные линии.

Рисунок 3 Доля неудлинённого праймера в зависимости от входного количества ДНК. Показаны диапазон и среднее для процента неудлинённого праймера для разного количества вводимой в ПЦР-реакцию ДНК. Число образцов, используемых в каждой категории, было 4 для 1-3 нг, 9 для 3-9 нг, 13 для 9-13 и 210 для 14 нг.

Рисунок 4 Чувствительное определение наличия мутаций в клинических образцах, фиксированных формалином и залитых парафином, с помощью платформы Sequenom. Показан небольшой, но чёткий мутантный пик, иллюстрирующий мутацию PIK3CA-1047R в приблизительно 5% от ДНК образца.

Рисунок 5. Количественная оценка чувствительности в эксперименте по смешиванию линий клеток. Показаны спектры клеток MCF-7 (мутант) отдельно или в смеси с клетками линии SKBR3 (дикий тип-ДТ). Проценты основаны на количестве ДНК в нг. Этот анализ позволяет обнаружить мутацию E545K в PIK3CA.

Большая часть характерных аминокислотных мутаций отражает данные базы данных COSMIC, однако, были найдены некоторые уникальные мутации генов рака толстой кишки, включающие ABL1-F359V, AKT1-E17K, MET-R970C, и MET-T992I. Другими аминокислотными изменениями, не включенными в базу данных COSMIC, были изменения R88Q, H701P, и C420R в PIK3CA, BRAF-594V/G, и KRAS-Q61R, и несколько в NRAS, включая G12C, G12D, G13R, G13V, Q61H и Q61K (таблица 2).

Мутации MET были обнаружены в C0-7 и амплифицированы в некоторых опухолях

Мутации MET были найдены в 3.3% образцов C-07. Интересно, что эти мутации были не только неожиданными в их возникновении в популяции клеток рака толстой кишки, но также и частота мутаций в образцах была неожиданной. В четырёх из восьми образцов с мутацией MET мутантные аллели присутствовали в 58-70%, что предполагает амплификацию мутантного аллеля или потерю гена дикого типа (рис. 6). Амплификация может явить собой лучшее объяснение, так как амплификация семейства генов MET, 7q31, наблюдалась в базе данных Progenetix CGH (база данных аномалий количества копий генов в злокачественных опухолях человека из экспериментов по сравнительной геномной гибридизации (CGH- Comparative Genomic Hybridization)) в 23% колоректальных раков [22].

Данные Sequenom были возпроизводимыми

Большая часть тестов панели OncoCarta не обнаруживала мутации в наших образцах рака толстой кишки, или их частота была очень низкой (менее 1%). Тесты панели OncoCarta исследуют мутации в этих 19 генах, перечисленных в таблице 1. Для уменьшения стоимости, времени и количества ДНК, необходимого для анализа, были отобраны только 24 теста, обнаруживавшие мутации в C-07 частотой 1% или выше, перегруппированы в 6 пулов и включены в новую панель, названную ColoCarta (таблица 3). Были ещё раз получены профили мутаций 32 мутантных образцов с 41 мутацией с использованием панели ColoCarta. Мутации, обнаруженные с помощью двух панелей (OncoCarta и ColoCarta) были идентичными, что демонстрирует воспроизводимость методики.

Частоты множественных мутаций предполагают порядок приобретения различных мутаций

Большинство опухолей (64%) содержало по крайней мере одну или более мутацию в следующих генах : BRAF, KRAS, NRAS, MET, или PIK3CA, и 18% содержали 2 или более мутации. Самая распространённая двойная мутация затрагивала гены KRAS и PIK3CA, следующей по частоте была комбинация PIK3CA и BRAF (таблица 4). Большинство образцов с мутациями PIK3CA (80%) также имели мутации в других генах, наиболее частыми из которых были мутации KRAS; другими мутировавшими генами были BRAF, MET, NRAS, и вторая мутация PIK3CA (таблица 2, последний столбец). Также опухоли с мутациями MET и NRAS имеют неожиданно высокую частоту одновременно присутствующих мутаций, что свидетельствует о том, что данные мутации возникают в качестве второй мутации и, возможно, позднее в этиологии опухоли. Многие опухоли содержат только мутацию KRAS или BRAF, что согласуется с полученными ранее данными, где данные мутации обнаруживаются в более ранних стадиях рака толстой кишки [23,24]. Частоты множественных мутаций в опухолях с мутациями KRAS и PIK3CA или с мутациями PIK3CA и BRAF были немногим более высокими или низкими, соответственно, чем предполагалось на основе их индивидуальных частот (таблица 4). Напротив, предполагаемая частота двойной мутации BRAF и KRAS должна была быть равной 5.1%, основываясь на наших данных, однако данная комбинация не была обнаружена, что также соответствует ранее сообщавшимся данным [24] (таблица 4).

Таблица 2 Частота мутаций рака толстой кишки

Мутация

Кол-во образцов с мутацией

Частота в первичной опухоли*

в COSMIC†

Множественные мутации*

ABL1-F359V

1

0.40%

0/66§

 

ABL1 Всего

1

0.40%

НО(0/66)§

100%

AKT1-E17K

1

0.40%

0/31 §

 

AKT1 Всего

1

0.40%

НО(0/31)§

100%

BRAF-D594V| G

1

0.40%

НО (0/3179)

 

BRAF-V600E

28

11.70%

14.60%

 

BRAF Всего

29

12.10%

14.70%

24%

KRAS-G12A

2

0.80%

1.80%

 

KRAS-G12C

10

4.20%

3.60%

 

KRAS-G12D

40

16.70%

13.20%

 

KRAS-G12R

3

1.30%

0.40%

 

KRAS-G12S

3

1.30%

4.20%

 

KRAS-G12V

20

8.40%

7.40%

 

KRAS-G13D

23

9.60%

5.20%

 

KRAS-A59T

1

0.40%

0.10%

 

KRAS-Q61L

1

0.40%

0.20%

 

KRAS-Q61R

1

0.40%

НО (0/1927)

 

KRAS Всего

104

43.50%

36.10%

34%

MET-R970C

2

0.80%

НО (0/77)

 

MET-T992I

6

2.50%

НО (0/77)

 

MET Всего

8

3.30%

0%

50%

NRAS-G12C

1

0.40%

НО (0/46)

 

NRAS-G12D

4

1.70%

НО (0/46)

 

NRAS-G13R

1

0.40%

НО (0/46)

 

NRAS-G13V

1

0.40%

НО (0/46)

 

NRAS-Q61H

1

0.40%

НО (0/46)

 

NRAS-Q61K

1

0.40%

НО (0/46)

 

NRAS Всего

9

3.80%

2.2%

38%

P/K3CA-R88Q

5

2.10%

НО (0/171)

 

P/K3CA-C420R

2

0.80%

НО (0/171)

 

P/K3CA-E542K

9

3.80%

4.10%

 

P/K3CA-E545K

12

5.00%

4.10%

 

P/K3CA-Q546K

4

1.70%

1.20%

 

P/K3CA-H701P

1

0.40%

НО (0/171)

 

P/K3CA-H1047L

1

0.40%

1.80%

 

P/K3CA-H1047R

14

5.90%

5.30%

 

PIK3CA Всего

48

20.10%

16.40%

80%

*% образцов C-07 с данной мутацией.
† Данные каталога COSMIC для аденокарциномы толстой кишки, ограниченные мутациями, включёнными в панель OncoCarta. Перечисленные мутации включают только мутации, найденные в исследовании C-07. Некоторые аминокислотные изменения, перечисленные в каталоге COSMIC, не показаны здесь, если они не были найдены мутантными в C-07.
*% образцов с мутацией в указанном гене и по меньшей мере одной другой мутацией в образцах C-07.
§ Данные COSMIC получены для толстой кишки, не ограничиваясь ободочной.
НО – не обнаружено.

Рисунок 6. Мутация MET амплифицирована. Показаны доля и положение (синие пунктирные линии) мутантного и дикого типов аллелей. Анализ MET_1 обнаруживает мутации R970C в гене MET.
НУП – неудлинённый праймер

Таблица 3 Панель ColoCarta

Название анализа Sequenom

Изменение аминокислоты

BRAF_15 &16

V600E/K/R/L

BRAF_9

BRAF-D594V

HRAS_6*

HRAS-Q61L

KRAS_1 & 2

G12V/A/D/C/S/R/F

KRAS_4

KRAS-G13D

KRAS_5

KRAS-A59T

KRAS_7

KRAS-Q61L

KRAS_8

Q61H/Q61H

MET_1

MET-R970C

MET_2

MET-T992I

NRAS_1

NRAS-G12V

NRAS_2

NRAS-G12C

NRAS_3

NRAS-G13V

NRAS_4

NRAS-G13C

NRAS_7

NRAS-Q61H

NRAS_8

NRAS-Q61E

P/K3CA_1

P/K3CA-R88Q

P/K3CA_3

P/K3CA-C420R

P/K3CA_5

P/K3CA-E542K

P/K3CA_6

P/K3CA-E545K

P/K3CA_7

P/K3CA-Q546K

P/K3CA_8

P/K3CA-H701P

P/K3CA_9

P/K3CA-H1047R

*HRAS_6 была включена в панель, однако встречалась в < 0.1% образцов.

Первичные опухоли с мутациями KRAS и PIK3CA отличаются в отношении частоты этих мутантных аллелей

В образцах с одновременно присутствующими мутациями определялось отношение коэффициента мутации KRAS (площадь пика мутации KRAS/общая площадь пика) к коэффициенту мутации PIK3CA (площадь пика мутации PIK3CA/общая площадь пика). Двадцать два из 31 образца (71%) имели отношения KRAS/PIK3CA более 1.25 (таблица 5). Мутации PIK3CA были более распространенными лишь в 2 из 31 образцах. Данные различия демонстрируют, что в большинстве первичных опухолей с двойными мутациями в генах KRAS и PIK3CA, мутации KRAS встречаются чаще, чем мутации PIK3CA. Это неравное распределение мутантных аллелей внутри опухоли может быть обусловлено фактом наличия в большинстве клеток опухоли только мутации KRAS, и малым количеством клеток с мутацией PIK3CA, либо это может быть связано с вариациями в количестве копий в локусах KRAS и PIK3CA.

Мутации BRAF ассоциировались с низкодифференцированными опухолями, а также с муцинозными опухолями

Частота мутаций KRAS, PIK3CA и BRAF исследовалась на предмет наличия корреляции со степенью дифференцировки и содержания муцина в опухоли.

Мутации BRAF были обнаружены в 26.2% из низкодифференцированных опухолей и в 8.2% средне- и высокодифференцированных. Различие частот было значимым при проведении теста Хи-квадрат (p = 0.001). Мутации BRAF также ассоциировались с муцинозными опухолями: Мутации BRAF встречались в 28% муцинозных опухолей степени дедифференцировки (grade) 3 (>50% муцинозных опухолевых клеток) и только в 9.4% немуцинозных опухолей (степени дедифференцировки 1 и 2). Данное различие также было значимым согласно критерию хи-квадрат при значении p = 0.006. Подобные данные сообщались ранее [25.26]. Мутации KRAS и PIK3CA не коррелировали ни со степенью дифференцировки, ни с содержанием муцинозных клеток.

Мутационный анализ продемонстрировал, что в большинстве образцов первичных опухолей и лимфатических узлов результаты совпадали, однако были обнаружены различия

Метастазы в лимфатические узлы отбирались не рутинно в исследовании C-07, но как пилотное исследование для определения возможности использования лимфатических узлов для проведения мутационного анализа. Мы изолировали ДНК из 39 лимфатических узлов, содержащих опухолевые клетки, и соответствующие им первичные опухоли. Эти образцы первичных опухолей и лимфатических узлов были проанализированы с помощью полной панели OncoCarta. Результаты анализа большинства лимфатических узлов и соответствующих им первичных опухолей (89.7%) совпадали. Всего было обнаружено 26 мутаций в лимфатических узлах, включая KRAS, BRAF, PIK3CA и NRAS. Тридцать пять из 39 лимфатических узлов имели идентичные мутационные профили, однако, в 4 случаях мутации первичной опухоли не были найдены в соответствующих лимфатических узлах (BRAF [2], PIK3CA [1] и KRAS [1]).

Таблица 4 Одиночные и двойные мутации в C-07

 

 

Частоты двойных мутаций

 

 

KRAS

PIK3CA

Все остальные

 

Одиночная

Наблюдаемая

Ожидаемая

Наблюдаемая

Ожидаемая

Наблюдаемая

Ожидаемая

KRAS

43.70%

NA

NA

10.40%

8.70%

14.60%

7.21%

PIK3CA

20.10%

10.40%

8.70%

NA

NA

15.50%

8.06%

BRAF

11.80%

0

5.10%

1.80%

2.40%

2.50%

5.71%

MET

3.30%

1.67%

1.44%

0

0.66%

1.67%

2%

NRAS

3.80%

0

1.66%

0.42%

0.40%

1.30%

2.14%

Все мутации

60.20%

 

 

 

 

 

 

Таблица 5 Отношение частот мутаций KRAS/PIK3CA в первичных опухолях

Кол-во образцов

KRAS/PIK3CA

22

1.25-3.22

7

0.93-1.13

2

0.81-.42

Среднее

1.67

Медиана

1.6

Мутационные профили демонстрируют, что популяции клеток могут быть различными в лимфатических узлах и первичной опухоли

Оценка площади пиков опухолей, которые имели 2 мутации, и у которых имелся лимфатический узел, показала различие между первичной опухолью и лимфатическим узлом. Таблица 6 детализирует частоты аллелей мутантного и дикого типов, основанные на площади пиков для 5 таких образцов.

Соотношения KRAS и PIK3CA продемонстрировали, что наблюдалось больше мутаций KRAS, чем мутаций PIK3CA в 4 из 4 образцах первичных опухолей, и в 3 из 4 образцах лимфатических узлов. Примечательно также, что отношение KRAS/PIK3A было более низким в лимфатическом узле в сравнении с соответствующей первичной опухолью в 3 из 4 образцах. В образце 0940, мутация KRAS/PIK3CA уменьшилась почти на 1/2 в поражённом лимфатическом узле в сравнении с первичной опухолью. Таким образом, в данных образцах происходит либо потеря мутаций KRAS, либо накопление мутаций PIK3CA, что предполагает возможность придания мутацией PIK3CA селективного преимущества в лимфатическом узле.

Таблица 6 Частоты аллелей для первичных опухолей с двумя мутациями и метастатических лимфатических узлов

Образец

Мутации

Частота мутантного аллеля

Отношения мутаций

Первичная опухоль

Лимфатический узел

Первичная опухоль M1/M2

Лимфатический узел M1/M2

C07-0388

M1

KRAS-G12D

0.45

0.44

1.88

 

1.63

 

M2

P/K3CA-H1047R

0.24

0.27

 

 

 

C07-0717

M1

KRAS-G13D

0.08

0.09

1.14

 

0.90

 

M2

P/K3CA-H1047R

0.07

0.1

 

 

 

C07-0940

M1

KRAS-G12D

0.42

0.34

1.91

 

1.10

 

M2

P/K3CA-E542K

0.22

0.31

 

 

 

C07-2244

M1

KRAS-G12C

0.37

0.15

1.76

 

 

 

M2

P/K3CA-H1047R

0.21

0

 

 

 

C07-1837

M1

BRAF-V600E

0.2

0.22

1.67

 

4.40

 

M2

P/K3CA-H1047R

0.12

0.05

 

 

 

Напротив, два других образца характеризуются менее частым возникновением мутации PIK3CA в лимфатическом узле, чем в первичной опухоли. В образце 2244 мутация PIK3CA не обнаруживалась в лимфатическом узле (таблица 6). В действительности, если бы существовала селекция для обеих мутаций в лимфатическом узле, то частота мутации PIK3CA была бы такой же, как и мутации KRAS (0,15). С другой стороны, если отношение PIK3CA/KRAS было бы одинаковым в первичной опухоли и опухоли лимфатического узла, то частота мутации PIK3CA была бы 0,08, что еще можно обнаружить с помощью данной технологии (рис. 3). Таким образом, в образце 2244 было меньше мутантных аллелей PIK3CA в лимфатическом узле, чем в первичной опухоли. В образце 1837 были обнаружены мутации как BRAF, так и PIK3CA, и отношение BRAF/PIK3CA составило 1.67, однако увеличилось до 4.4 в метастатическом лимфатическом узле.

Обсуждение

Платформа Sequenom обеспечивает передовую технологию для скрининга многих мутаций «горячих точек» в образцах злокачественных опухолей.

Секвенирование по методу Сэнгера потребовало бы амплификации по крайней мере 60 различных фрагментов на образец, и многие реакции потребовали бы оптимизации, таким образом значительно увеличивая время и расходы. Мультиплексирование и использование панели OncoCarta позволили нам пропустить этот требующий времени шаг. Таким образом, использование консервативного метода секвенирования по Сэнгеру было бы в 40 раз дороже, и потребовало бы как минимум в 2 раза больше ДНК. Другие технологии секвенирования, которые используют дифференцированное плавление последовательностей мутантного и дикого типов, такие как HRMA (анализ кривых плавления с высоким разрешением), все еще требуют секвенирования продукта ПЦР. Это значительно увеличило бы стоимость и время процедуры, поскольку 60% образцов толстой кишки содержало одну или более мутаций. В дополнение, платформа Sequenom более чувствительна, чем секвенирование по Сэнгеру, будучи способной обнаружить мутации, представленные только в 5% ДНК. Пиросеквенирование являлось потенциальной альтернативой платформе Sequenom, но в наших руках тесты необходимо было оптимизировать, а отсутствие мультиплексирования сделало процедуру более затратной по времени и требующей большее количество ДНК. Также методика Sequenom фокусируется лишь на тех нуклеотидах, которые известны как опухолевые мутации, и, таким образом, делает просмотр данных последовательности значительно более быстрым, чем метод Сэнгера. Методы секвенирования нового поколения являются чрезвычайно дорогими, также не было показано, что данные методики работают с ДНК, изолированной из парафиновых блоков ткани, обработанной формалином. Таким образом, платформа Sequenom и панель OncoCarta обеспечили наиболее простой, быстрый, чувствительный и экономичный метод обнаружения раковых мутаций "горячих точек" фрагиентированной ДНК, изолированной из архивных препаратов и обработанных обычным образом формалином и парафином кусочков тканей. Панель ColoCarta является более специфичной панелью для обнаружения мутаций генов рака толстой кишки и в значительной мере уменьшает количество ДНК, необходимой для мутационного анализа.

Частоты мутаций и обнаруженные замены конкретных аминокислот были подобны данным базы данных COSMIC и данным других публикаций [6]. Небольшие различия в частоте между нашими данными и другими сообщениями могут объясняться различиями в стадии анализируемых образцов, числе рассматриваемых образцов, и чувствительности технологии [18]. Эти наблюдения, в сочетании с идеальным совпадением, которое мы получили между ожидаемыми и обнаруженными мутациями в наших контрольных клеточных линиях, как в свежих образцах, так и в прошедших обработку формалином и парафином, и тот факт, что мутации, обнаруженные при помощи панелей OncoCarta и ColoCarta были идентичными, предполагает, что технология надёжна и воспроизводима при использовании ДНК, изолированной из образцов тканей, прошедших обработку формалином и парафином.

В нашем исследовании большинство опухолей (60.3%) имело одну или более мутаций в генах KRAS, PIK3CA и BRAF. Мутации в этих генах, по всей видимости, вносят изменения во многие различные и перекрывающиеся сигнальные пути, включая PI3K/AKT, ERK/MAPK, SAPK/JNK, NKFβ и другие. Мы также смогли обнаружить другие, менее частые мутации, которые, скорее всего, вносят изменения в те же пути, что может вызвать устойчивость к схемам терапии, направленным на EGFR, как сообщалось для KRAS, PIK3CA и BRAF. Например, AKT1 и NRAS являются молекулами-медиаторами каскада сигнального пути EGFR, и мутации в этих генах могут повлиять на ответ на лекарственные средства, мишенью действия которых является EGFR.

Мутации в ABL, AKT1 и MET были обнаружены здесь, но не были упомянуты в базе данных COSMIC, вероятно, из-за малого количества проанализированных образцов. Мутация AKT1-E17K первоначально была определена как однонуклеотидный полиморфизм, rs34409589, однако в недавней публикации было обнаружено, что она является соматической мутацией, мутация была найдена в 3 из 51 образцов рака толстой кишки [27]. Частота данных мутаций в этом небольшом исследовании (51 образец) составила 6%, что намного больше, чем в образцах C0-7 (0,4%). Эта разница в частотах может объясняться тем, что образцы в исследовании Carpten et al [27] были взяты от пациентов с более поздними стадиями заболевания, чем у пациентов в исследовании C-07. Кроме того, они отбирали большие опухоли (>100 мг) с содержанием опухолевых клеток более 60%. Такого отбора не проводилось в нашем исследовании, и образцы были взяты исключительно от пациентов с II и III стадией заболевания. Значение мутаций ABL1 и AKT1 для прогноза пациента в нашем исследовании сомнительно, учитывая, что каждая из них была найдена только в одном образце и составила лишь 0,4% случаев.

Насколько нам известно, это первое сообщение о мутации MET в первичном раке толстой кишки, однако, другая мутация MET (N1118Y) была обнаружена в лёгочных метастазах рака толстой кишки [28]. Мутации MET, R970C и T992I, были обнаружены в 8 из 239 образцах рака толстой кишки в исследовании C-07. Эти мутации соответствуют MET-R988C и MET-T1010I, соответственно, в длинной форме MET, которая является изоформой, упоминаемой в базе данных COSMIC [29]. Мутации R970C и T992I расположены в юкстамембранном сегменте белка, и были обнаружены в раке лёгких [30]. Эти мутации, после внесения их в линию клеток лёгкого, увеличивали формирование очагов, образование колоний в мягком агаре, подвижность клеток и миграцию. Данные мутации также привели к стабильному фосфорилированию тирозина нескольких клеточных белков, включая паксиллин, по ключевым остаткам тирозина, что может определять увеличение подвижности клеток с этой мутацией. Другой критической аминокислотой в этом положении является Ser 985, которая, будучи фосфорилированной, уменьшает, как было обнаружено, сигнал MET [31]. Если фосфорилирование по остатку Thr 992 (1010) уменьшает интенсивность сигнала, то мутация R992I блокирует эту отрицательную обратную связь, что приводит к постоянной активности сигнала [30].

Если мутации МЕТ обеспечивают альтернативный активный сигнальный путь, то эти мутации, возможно, также придают устойчивость к анти-EGFR режимам терапии, либо обеспечивают новую мишень для таргетной терапии. Были разработаны лекарственные средства, направленные на МЕТ, включая малые молекулы ингибиторов тирозинкиназы, моноклональные антитела к MET, а также ингибиторы HGF (фактора роста гепатоцитов), лиганда МЕТ. Анализы in vitro продемонстрировали, что несколько схем терапии, направленных на MET, смогли предотвратить сигнал MET, уменьшить жизнеспособность клеток, а также ограничить подвижность клеток и клеточную миграцию in vitro [32]. Начаты клинические исследования II фазы малой молекулы ARQ 197, ингибитора тирозинкиназы, которая может представлять возможную терапевтическую стратегию для некоторых опухолей толстой кишки.

Насколько нам известно, данное исследование также является одним из самых исчерпывающих мутационных анализов поражённых метастазами лимфатических узлов и их соответствия первичной опухоли толстой кишки. Наш анализ показал, что большинство образцов совпадали (89.7%), однако в небольшом количестве образцов мутации были обнаружены лишь в первичной опухоли, и не были обнаружены в метастатическом лимфатическом узле. Также в образцах с двумя одновременно присутствующими мутациями, отношения двойных мутаций были различными в первичной опухоли и опухоли лимфатических узлов. Наблюдалось несоответствие в генетическом профиле между первичной опухолью и метастатическими лимфатическими узлами [33]. Такого рода данные могут указывать на то, что в ходе миграции опухолевых клеток происходит отбор различных популяций клеток из популяции первичной опухоли. Однако возможно и то, что эта разница в мутациях между лимфатическими узлами и первичной опухолью является результатом гетерогенности опухоли.

Другим интересным наблюдением в нашем исследовании было то, что мутации BRAF в значительной степени коррелировали с низкодифференцированными опухолями и содержанием муцина; аналогичные наблюдения сообщались ранее [25,26]. Эти характеристики связаны с худшим прогнозом и сопоставимы с другими публикациями, в которых мутация BRAF ассоциируется с плохим прогнозом [3]. Однако в нашем исследовании мы обнаружили 2 метастатических лимфатических узла, в которых не содержалось мутации BRAF, присутствующей в соответствующей первичной опухоли, что позволяет предположить, что мутации BRAF не являются ключевыми для метастатического распространения в лимфатический узел во всех опухолях. Очевидно, необходимы дополнительные исследования для понимания этих кажущихся несоответствий; дополнительные образцы лимфатических узлов в настоящее время недоступны, однако могут стать предметом дальнейших исследований, когда будут получены образцы [3].

Выводы

Платформа Sequenom обеспечила передовую технологию для скрининга 238 наиболее часто встречающихся мутаций в "горячих точках" 19 генов опухолевых клеток. Было подтверждено частое возникновение мутаций KRAS, PIK3CA и BRAF, были также найдены мутации MET и ABL1, не обнаруживавшиеся ранее в клетках рака толстой кишки. Двадцать пять тестов панели OncoCarta были сгруппированы для формирования новой панели, называемой ColoCarta, которая будет использована для скрининга ещё 800 образцов опухолей из исследования C0-7 NSABP с целью идентификации прогностических маркеров рака толстой кишки II и III стадии.

Замечание, внесённое авторами после поступления статьи в печать: Хотя мутации MET-R988C и MET-T1010I были перечислены базе данных COSMIC как соматические опухолевые мутации, эти нуклеотидные изменения соответствуют однонуклеотидным полиморфизмам rs34589476 и rs56391007 в базе данных NCBI SNP (база данных однонуклеотидных полиморфизмов Национального центра биотехнологической информации США), соответственно. Частота для этих однонуклеотидных полиморфизмов неизвестна, таким образом, остаётся неизвестным, связаны ли эти нуклеотидные изменения со злокачественными опухолями.

Выражение благодарности

Авторы хотели были бы поблагодарить Melanie Finnigan, Bill Hiller, и Theresa Oeler за помощь в в изготовлении и каталогизации срезов, а также Hema Liyanage из компании Sequenom за перегруппировку анализов. Это исследование было проведено за счёт грантов государственной службы здравоохранения U10-CA-37377, U10-CA-69974, U10-CA-12027 и U10- CA-69651 Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, а также министерства здравоохранения и социального обеспечения. Этот проект частично финансируется грантом департамента здравоохранения штата Пенсильвания. Департамент особо подчёркивает свой отказ от ответственности за любые анализы, интерпретации или выводы. Авторы сохраняют право предоставлять копию окончательного варианта рукописи в Национальные институты здравоохранения для принятия к публикации, для архивирования и общественного пользования в базе данных PubMed Central как можно скорее, однако не позднее, чем через 12 месяцев после публикации в журнале.

Вклад авторов

DF и PGG разработали и провели эксперименты, а также участвовали в подготовке рукописи. YT классифицировал опухоли по степени дифференцировки, содержания муцина, и определял зоны опухоли, S-IK проводил эксперименты. H-JC определял зоны опухоли; SP участвовал в координации исследования; KLP-G разрабатывал и координировал исследование и готовил рукопись. Все авторы окончательно одобрили вариант рукописи, направленный к публикации.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что они не имеют никаких конкурирующих интересов.

Получено: 12 августа 2009 г. Принято: 16 марта 2010 г. Опубликовано: 16 марта 2010 г.

Литература

  1. Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, Shima K, Irahara N, Kure S, Chan AT,
    Engelman JA, Kraft P, Cantley LC, et a/: PIK3CA Mutation Is Associated With Poor Prognosis Among Patients With Curatively Resected Colon Cancer. J C/in Onco/ 2009.
  2. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, Oates J, Dix BR, Iacopetta BJ, Young J, Walsh T, Ward R, Hawkins N, et a/: Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br J Cancer 2001, 85(5):692-696.
  3. Samowitz WS, Sweeney C, Herrick J, Albertsen H, Levin TR, Murtaugh MA, Wolff RK, Slattery ML: Poor Survival Associated with the BRAF V600E Mutation in Microsatellite-Stable Colon Cancers. Cancer Res 2005,
    65(14):6063-6069.
  4. Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, Kawasaki T, Meyerhardt JA, Loda M, Giovannucci EL, Fuchs CS: CpG island methylator phenotype, microsatellite instability, BRAF mutation and clinical outcome in colon cancer. Gut 2009, 58(1):90-96.
  5. Conlin A, Smith G, Carey FA, Wolf CR, Steele RJC: The prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. Gut 2005, 54(9):1283-1286.
  6. Barault L, Veyrie N, Jooste V, Lecorre D, Chapusot C, Ferraz JM, Lievre A, Cortet M, Bouvier AM, Rat P, et a/: Mutations in the RAS-MAPK, PI(3)K (phosphatidylinositol-3-OH kinase) signaling network correlate with poor survival in a population-based series of colon cancers. nt J Cancer 2008, 122(10):2255-2259.
  7. Khambata-Ford S, Garrett CR, Meropol NJ, Basik M, Harbison CT, Wu S,
    Wong TW, Huang X, Takimoto CH, Godwin AK, et a/: Expression of epiregulin and amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab.
    J C/in Onco/ 2007, 25(22):3230-3237.
  8. Linardou H, Dahabreh IJ, Kanaloupiti D, Siannis F, Bafaloukos D, Kosmidis P, Papadimitriou CA, Murray S: Assessment of somatic k-RAS mutations as a mechanism associated with resistance to EGFR-targeted agents: a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer. The Lancet Oncoiogy 2008, 9(10) :962-972.
  9. Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M,
    Bouche O, Landi B, Louvet C, et ai: KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Ciin Oncoi 2008, 26(3):374-379.
  10. Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, et ai: Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Ciin Oncoi 2008, 26(10):1626-1634.
  11. Baselga J, Rosen N: Determinants of RASistance to anti-epidermal growth factor receptor agents. J Ciin Oncoi 2008, 26(10):1582-1584.
  12. Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, Veronese S, Nichelatti M, Artale S,
    Di Nicolantonio F, Saletti P, De Dosso S, Mazzucchelli L, et ai: PIK3CA Mutations in Colorectal Cancer Are Associated with Clinical Resistance to EGFR-Targeted Monoclonal Antibodies. Cancer Res 2009, 69(5):1851-1857.
  13. Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, Saletti P, De Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, et ai: Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. J Ciin Oncoi 2008, 26(35):5705-5712.
  14. Lambrechts D, De Roock W, Prenen H, De Schutter J, Jacobs B, Biesmans B, Claes B, De Hertogh G, Van Cutsem E, Tejpar S: The role of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations as markers of resistance to cetuximab in chemorefractory metastatic colorectal cancer. J Ciin Oncoi (Meeting Abstracts) 2009, 27(15S):4020.
  15. Prenen H, De Schutter J, Jacobs B, De Roock W, Biesmans B, Claes B, Lambrechts D, Van Cutsem E, Tejpar S: PIK3CA Mutations Are Not a Major Determinant of Resistance to the Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab in Metastatic Colorectal Cancer. Ciin Cancer Res 2009.
  16. Thomas RK, Baker AC, Debiasi RM, Winckler W, Laframboise T, Lin WM,
    Wang M, Feng W, Zander T, MacConaill L, et ai: High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat Genet 2007, 39(3):347-351.
  17. Wood LD, Parsons DW, Jones S, Lin J, Sjoblom T, Leary RJ, Shen D,
    Boca SM, Barber T, Ptak J, et ai: The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science 2007, 318(5853):1108-1113.
  18. Vivante A, Amariglio N, Koren-Michowitz M, Ashur-Fabian O, Nagler A, Rechavi G, Cohen Y: High-throughput, sensitive and quantitative assay for the detection of BCR-ABL kinase domain mutations. Leukemia 2007, 21(6):1318-1321.
  19. van Puijenbroek M, Dierssen JW, Stanssens P, van Eijk R, Cleton-Jansen AM, van Wezel T, Morreau H: Mass spectrometry-based loss of heterozygosity analysis of single-nucleotide polymorphism loci in paraffin embedded tumors using the MassEXTEND assay: single-nucleotide polymorphism loss of heterozygosity analysis of the protein tyrosine phosphatase receptor type J in familial colorectal cancer. J Moi Diagn 2005, 7(5):623-630.
  20. Kuebler JP, Wieand HS, O'Connell MJ, Smith RE, Colangelo LH, Yothers G, Petrelli NJ, Findlay MP, Seay TE, Atkins JN, et ai: Oxaliplatin combined with weekly bolus fluorouracil and leucovorin as surgical adjuvant chemotherapy for stage II and III colon cancer: results from NSABP C-07. J Clin Oncol 2007, 25(16):2198-2204.
  21. Forbes SA, Bhamra G, Bamford S, Dawson E, Kok C, Clements J, Menzies A, Teague JW, Futreal PA, Stratton MR: The Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC). Curr Protoc Hum Genet 2008, Chapter 10(Unit 10):11.
  22. Baudis M, Cleary ML: Progenetix.net: an online repository for molecular cytogenetic aberration data. BioiНОormatics 2001, 17(12):1228-1229.
  23. Pratilas C, Solit D: Therapeutic strategies for targeting BRAF in human cancer. Rev Recent Ciin Triais 2007, 2(2):121-134.
  24. Yuen ST, Davies H, Chan TL, Ho JW, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Tsui WW, Chan AS, et ai: Similarity of the phenotypic patterns associated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoplasia. Cancer Res 2002, 62(22):6451-6455.
  25. Tanaka H, Deng G, Matsuzaki K, Kakar S, Kim GE, Miura S, Sleisenger MH,
    Kim YS: BRAF mutation, CpG island methylator phenotype and microsatellite instability occur more frequently and concordantly in mucinous than non-mucinous colorectal cancer. nt J Cancer 2006, 118(11):2765-2771.
  26. Li WQ, Kawakami K, Ruszkiewicz A, Bennett G, Moore J, Iacopetta B: BRAF mutations are associated with distinctive clinical, pathological and
    molecular features of colorectal cancer independently of microsatellite instability status. Moi Cancer 2006, 5:2.
  27. Carpten JD, Faber AL, Horn C, Donoho GP, Briggs SL, Robbins CM,
    Hostetter G, Boguslawski S, Moses TY, Savage S, et ai: A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer. Nature 2007, 448(7152):439-444.
  28. Lorenzato A, Olivero M, Patane S, Rosso E, Oliaro A, Comoglio PM, Di Renzo MF: Novel Somatic Mutations of the MET Oncogene in Human Carcinoma Metastases Activating Cell Motility and Invasion. Cancer Res 2002, 62(23):7025-7030.
  29. Loriaux MM, Levine RL, Tyner JW, Frohling S, Scholl C, Stoffregen EP,
    Wernig G, Erickson H, Eide CA, Berger R, et ai: High-throughput sequence analysis of the tyrosine kinome in acute myeloid leukemia. Biood 2008, 111(9) :4788-4796.
  30. Ma PC, Kijima T, Maulik G, Fox EA, Sattler M, Griffin JD, Johnson BE, Salgia R: c-MET Mutational Analysis in Small Cell Lung Cancer: Novel Juxtamembrane Domain Mutations Regulating Cytoskeletal Functions. Cancer Res 2003, 63(19):6272-6281.
  31. Hashigasako A, Machide M, Nakamura T, Matsumoto K, Nakamura T: Bi­directional Regulation of Ser-985 Phosphorylation of c-Met via Protein Kinase C and Protein Phosphatase 2A Involves c-Met Activation and Cellular Responsiveness to Hepatocyte Growth Factor. J Bioi Chem 2004, 279(25):26445-26452.
  32. Seiwert TY, Jagadeeswaran R, Faoro L, Janamanchi V, Nallasura V, El Dinali M, Yala S, Kanteti R, Cohen EE, Lingen MW, et ai: The MET receptor tyrosine kinase is a potential novel therapeutic target for head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 2009, 69(7):3021-3031.
  33. Gamblin TC, Finkelstein SD, Upsal N, Kaye JD, Blumberg D: Microdissection- based allelotyping: a novel technique to determine the temporal sequence and biological aggressiveness of colorectal cancer. Am Surg 2006, 72(5):445-453.

Информация о статье до публикации
Информацию о статье до её публикации можно получить по адресу:
[http://www.biomedcentral.com/1471-2407/10/101/prepub]
doi:10.1186/1471-2407-10-101
Цитировать данную статью как: Fumagalli et al.: A rapid, sensitive, reproducible and cost-effective method for mutation profiling of colon cancer and metastatic lymph nodes. BMC Cancer 2010 10:101.



Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных