В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Идентификация вариантов вируса гепатита B с помощью генетического анализатора MassARRAY 4


Мультиплексная идентификация шестидесяти вариантов вируса гепатита B с помощью матрично-активированной десорбционной ионизационной лазерной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF)

Ю. Луан, Цзинь Юань, Хиаохе Ли, Шенгнан Джин, Лин Ю, Мингфенг Ляо, Хонгмей Чжан, Ченг Сюй, Цин Он, Бин Вэнь Цзябао, Сюньхуа Чжун, Синьчунь Чен, Генри Ли Чан, Джозеф Д.У. Сен, Бопинг Чжоу и Чамнинг Динг

Предпосылки: Изменения в геноме вируса гепатита B (HBV) могут развиваться как спонтанно, так и быть вызваны селективно действием противовирусной терапии. Такие изменения могут привести к лекарственной резистентности или повлиять на репликативную способность вируса, результатом чего может стать не эффективность противовирусного лечения.

Методы: Для амплификации последовательности гена обратной транскриптазы использовали дуплексную ПЦР, геном вируса гепатита амплифицируется прекоровым промотором и базальным основным промотором. Для детального исследования шестидесяти вариантов гепатитов В (HBV), которые наиболее часто встречаются в ходе противовирусной терапии, были использованы четыре мультиплексные реакции с добавочным праймером. Для обнаружения мутаций была использована автоматизированная масс-спектрометрическая система MALDI-TOF. Для подтверждения результатов, полученных с помощью масс-спектрометра, был использован капиллярный секвенатор.

Результаты: Предел количественного анализа для мультиплексного обнаружения вариантов вируса гепатита составлял 1 000 копий на один миллилитр.

Пятьдесят три варианта вируса были успешно проанализированы, это эквивалентно минимум 90% ИФА анализа. Образцы были взяты от 88 больных, не получавших лечение, и 80 пациентов на стадии вирусного прорыва. Используя метод масс-спектрометрии, удалось обнаружить в два раза больше второстепенных форм, чем при прямом секвенировании, при практически полной автоматизации всего процесса идентификации. При прямом секвенировании и применении масс-спектрометрии наблюдались незначительные расхождения полученных данных (порядка 0,1%).

Выводы: Данная платформа на базе времяпролетного масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS) и мультиплексного анализа добавочного праймера обнаруживает 60 вариантов вируса гепатита в 4 мультиплексных реакциях с высокой точностью и низкими пределами обнаружения.

Во всем мире насчитывается около 400 миллионов человек, хронически инфицированных вирусом гепатита (HBV) (5). Хроническое заболевание гепатитом является наиболее распространенной причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы, что по разным оценкам составляет 500 000 - 900 000 смертей в год. Прогрессирующая репликация HBV увеличивает риск развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (1-4). Таким образом, противовирусная терапия, направленная на блокирование репликации вируса, имеет важное медикаментозное значение в лечении хронических больных. Для проведения противовирусного лечения был одобрены ряд терапевтических препаратов нуклеозидов или аналогов нуклеотидов, таких как ламивудин, адефовир дипивоксил, телбивудин, энтекавир и тенофовир. К сожалению, при длительной противовирусной терапии часто наблюдается изменчивость вируса (5). Некоторые вирусы становятся резистентными к лекарственным препаратам, эффективность лечения снижается, что может являться причиной повторной реактивации вируса и печёночной недостаточности (6).

Мониторинг количественной вирусной нагрузки HBV обычно используется для получения обратной связи на противовирусное лечение и для раннего выявления лекарственной устойчивости вируса (7, 8). Прямая идентификация наиболее клинически значимых вариантов HBV является также эффективным методом для раннего выявления лекарственной устойчивости (9, 10). Для ряда вирусных форм было хорошо описано функциональное значение при терапевтической резистентности (5). Другие варианты вирусов были обнаружены в образцах сыворотки от пациентов, прошедших противовирусную терапию; однако, функциональная роль этих вариантов не была тщательно изучена. Многообразие вариантов HBV может увеличиваться в результате использования новых противовирусных препаратов и новых комбинаций различных противовирусных агентов.

Существует ряд доступных технических методов для обнаружения вариантов HBV. Капиллярное секвенирование может обнаружить любое изменение в нуклеотидной последовательности в пределах анализируемой мишени-локуса. Тем не менее, при использовании этого метода довольно часто не удается обнаружить варианты HBV с низкой частотой встречаемости, поскольку сигналы от мутантных форм вируса незначительны и не распознаются на фоне сигналов последовательности вируса дикого типа. Коммерческие анализ линии INNO-LiPA HBV DR (Innogenetics) использует метод обратной гибридизации амплифицированных ДНК фрагментов HBV вместе со специальными нуклеотидными зондами-мишенями. Зонды иммобилизованы на полоски из нитроцеллюлозы, это позволяет обнаружить лекарственно-устойчивые варианты как на низких частотах -5%, так и в смешанных вирусных популяциях (10). Такой вариант анализа стоит дорого, его трудно адаптировать к вновь выявленным вирусным вариантам, поэтому весьма ограничен с точки зрения охвата большого количества вирусных вариантов HBV. В последнее время нами и другими исследователями активно используется автоматизированная масс-спектрометрическая система MALDI-TOF для высокопропускной идентификации вариантов вирусов HBV (9, 11). Такой анализ может обнаруживать мутантные штаммы вплоть до частоты 5% в смешанных вирусных популяциях. В этом исследовании мы разработали и осуществили валидацию четырех высокомультиплексных панелей (анализов) для обнаружения шестидесяти наиболее часто встречающихся вариантов вирусов HBV, взятых из большой выборки пациентов, перенесших различные противовирусные процедуры.

Материалы и методы
Популяционная принадлежность пациентов и сбор образцов

Образцы плазмы были собраны в промежутке между августом 2007 года и июнем 2008 года. Образцы отбирались у пациентов, инфицированных вирусом гепатита, в больнице Шэньчжэнь Донгху, КНР, после получения от них информированного согласия. Настоящее исследование было одобрено научно-клиническим комитетом по этике Китайского Университета Гонконга и больницы Донгху, КНР. Из этих 168 пациентов, 88 пациентов (71,6% мужчин; возраст от 18-62 лет; средний возраст, 32 года) не получали никакой противовирусной терапии; 80 пациентов (80% мужчин; возрастной диапазон 21- 65 лет; средний возраст, 32 года) находились на стадии вирусного прорыва (возрастание вирусной ДНК >1 log, с низшего придела и концентрация >100 000 копий в одном миллилитре).

Периферическая кровь собиралась у каждого пациента в пробирки с красной крышкой, без антикоагулянта. После центрифугирования в течение 1 ч, 1,5 мл сыворотки отбирали для последующего хранения при -80°С. Нуклеиновые кислоты вирусов выделяли из сыворотки с помощью набора для выделения QIAampDNABlood Mini фирмы Qiagen в соответствии с инструкциями изготовителя [спин протокол - очистка ДНК из крови или биологических жидкостей]. Мы использовали 800 мкл сыворотки для извлечения ДНК в объеме элюирования 50 мкл. Вирусную нагрузку каждого образца определяли с помощью флуоресцентного набора реагентов ПЦР компании PG Biotech (12).

Обнаружение вариантов вирусов

Обнаружение вариантов вирусов складывалось из четырех основных шагов с привлечением системы масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Таблица 1 в подразделе Приложения, который включён в онлайн-версию этой статьи (http://www.clinchem.org/content/vol55/issue8), содержит список выбранных вариантов вирусов. В Таблице 2 в подразделе Приложения представлены последовательности и молекулярные массы удлинительных праймеров и продуктов удлинения. Все праймеры были приобретены с учетом интеграции ДНК технологий. Все другие реагенты были приобретены у компании Sequenom, если не указано иное.

Шаг 1: Двойная ПЦР амплификация интересующей последовательности HBV

Обратная транскриптаза и базальный кор-промотор (минимальный промотор)/прекорновая область были выбраны, потому что эти две области содержат функционально важные варианты, а также варианты, которые часто наблюдаются у пациентов, перенесших противовирусную терапию (См. Таблицу 2). Мы использовали две пары ПЦР праймеров (25IF-tag: 5’-gttggatgGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’ и 1004R-tag: 5’-ggatgCCCACAATTCKTTGACATACTTTCC-3’; 1593F-tag: 5’-acgttggatgACCTCTGCACGTYRCATGGA-3’ и 1950R-tag: 5’-ggatgGAGAGTAACTCCACAGTAGCTCCAA-3’) для амплификации этих двух областей (последовательностей) в процессе двойной ПЦР образуются 2 ампликона, 754 п.о. и 358 п.о. соответственно. В буквенных последовательностях праймеров строчные буквы содержат метку. Это сделано для того, чтобы они не мешали при чтении масс-спектров. В 25 мкл ПЦР-реакционной смеси содержалось 5 мкл ДНК вируса гепатита В, 200 нмоль/л каждого из праймеров 251F- tag (tag - с масс-меткой, примечание переводчика) и праймера 1004R-tag, далее - 100 нмоль/л каждого из праймеров 1593F-tag и 1950R-tag, буфер горячего старта 1 X HotStar Taq buffer (с 1.5 ммоль/л Mg2+), 1.0 ммоль /л дополнительного Mg2+, 200мкмоль/л каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (дНТФ), и 0.5U Taq-полимеразы горячего старта фирмы Qiagen. ПЦР ставили при +95°С в течение 15 мин, а затем проводили 45 циклов денатурации при +95°С в течение 40 с, отжиг - при +57°С в течение 30 с и удлинение при +72°С в течение 1,5 мин. Окончательное удлинение проводили при +72°С в течение 3 мин.

Шаг 2: Обработка креветочной щелочной фосфатазой

Для удаления оставшихся дНТФ после ПЦР, мы смешали 5 мкл продукта ПЦР с 2 мкл раствора щелочной фосфатазы креветки (SAP), в составе: 1,53 мкл H2O, 0,17 мкл SAP 10 X буфера и 0,3 мкл SAP фермента (1,7 U/л концентрация исходного раствора). Реакцию проводили при +37°С в течение 40 мин и прекращали путем инактивации при +85 ° С в течение 5 мин.

Шаг 3: Мультиплексная реакция удлинения праймера

Были проанализированы шестьдесят отобранных вариантов вирусов в четырех отдельных реакциях удлинения праймера (в первой реакции было двенадцать плексов, во второй и третьей реакциях по семнадцать плексов и четырнадцать плексов в четвертой реакции). Буквенные последовательности добавочных праймеров приведены в таблице Таблице 2 (онлайн подраздел Приложения). В 9 мкл смеси для реакции добавочного праймера содержится: 7 мкл ПЦР/SAP продуктов, 0,2 мкл 10X буфера Iplex Plus и 0,2 мкл терминирующей смеси с измененными дидеокси NTP, смесь добавочных праймеров (в Таблица 2 приведены дополнительные сведения о каждом из праймеров) и 0,041 мкл фермента термосеквеназа iPLEX. На рис. 1 см стандартный температурный профиль для iPLEX реакции.

Шаг 4: Подготовка образцов и анализ на масс-спектрометре

Нами проведена процедура обессоливания конечных продуктов ПЦР для последующего масс-спектрометрического анализа. Для этого добавили 16 мкл дважды дистиллированной воды и 6 мг катионообменной смолы. После центрифугирования при ускорении 360 g в течение 5 мин, робот Нанодиспенсер (Nanodispenser) осуществил перенос около 15 нл реакционной смеси на спектральный чип 384-луночного формата. Анализ данных со спектрального чипа был проведен платформой Sequenom MALDI-TOF MS, биоинформационная обработка данных выполнена программой TyperAnalyzer Application, версия 4.0 компании Sequenom. В Таблице 2 в онлайн режиме приведены данные об ожидаемых молекулярных массах для добавочных праймеров и продуктов их амплификации.

Капиллярное секвенирование

Для валидации данных, полученных методом масс-спектрометрии, нами были отобраны в случайном порядке 70 образцов для секвенирования (35 пациентов, не получавших лечение, и 35 пациентов со значительным увеличением вирусной нагрузки). Те же самые продукты ПЦР (см выше, шаг 1), которые были использованы до стадии обработки щелочной фосфатазой, были использованы для прямого секвенирования с помощью набора реагентов BigDye Terminator Cycle Sequencing, версия 3.0, компании Applied Biosystems, на генетическом анализаторе ABI 3100 Genetic Analyzer компании Applied Biosystems.
Со следующей последовательностью праймеров: 5’-gttggatgGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’ (ПЦР праймер), 5’-ggatgGAGAGTAACTCCACAGTAGCTC CAA-3’ (ПЦР праймер), 5’-GYGCCATTTGTTCAGTG GTTCG-3’, и 5’-AAACATAGAGGTTCCTTGAGC AGG-3’.

Результаты

Главная цель нашего исследования заключалась в разработке тест-анализа для обнаружения (идентификации) вариантов вирусов гепатита. Данный анализ может (а) анализировать все функционально важные мутации, а также другие возможные варианты вирусов, часто наблюдающиеся при противовирусной терапии. Анализ является достаточно гибким (b), существует возможностью включать в него вновь выявленные варианты достаточно просто и легко. Анализ (с) может работать при достаточно низкой количественной вирусной нагрузке (например, 1 000 копий/мл сыворотки). Анализ (d) является универсальным, он применим ко всем генотипам HBV. Анализ (е) является экономически эффективным и оправданным и (f) имеет высокую пропускную способность. Автоматизированная платформа MALDI-TOF MS была выбрана, потому что она широко используется для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов при мультиплексном анализе. По химическому строению SNP практически неотличимы от большинства вариантов HBV; тем не менее, обнаружить варианты HBV (и другие вирусы, штаммы, например такие как ВИЧ) в мультиплексном анализе, как правило, намного труднее, потому что плотность и концентрация встречаемости вирусных вариантов на вирусный геном гораздо выше по сравнению с человеческими SNP, и наконец, вирусы могут существовать в виде псевдо-видов, в результате такие варианты присутствуют в небольших следовых количествах, в то время как гетерозиготные SNP присутствуют в соотношении 1: 1. В силу всего вышеперечисленного, осуществить подбор последовательностей в высоко консервативных областях вирусного генома, для последующего дизайна ПЦР-праймеров, задача далеко не тривиальная, особенно если учесть требование к чувствительности мультиплексной системы. Кроме того, при разработке высоко мультиплексного анализа для обнаружения вирусных вариантов следует уделять особо внимание добавочным праймерам, которые необходимы для идентификации SNP, чтобы избежать в дальнейшим такого нежелательного явления, как перекрестная гибридизация праймеров.

Выбор вариантов вируса гепатита

Нами был проведен поиск всех известных мутаций HBV, которые по опубликованным данным непосредственно связаны с лекарственной противовирусной устойчивостью (см Таблицу 1). Также была включена информация о мутации в малом промоторе последовательности G1896A и C1858T и мутации в основной части главного промотор A1762T и G1764A. Эти варианты, которые часто наблюдались в ходе противовирусной терапии, но их роль в противовирусной резистентности была не достаточно доказана. Поэтому они также были учтены и добавлены в создаваемые панели. Это было сделано с прицелом на большие выборки для достоверного выяснения роли этих мутаций в противовирусной терапии.

Концентрация ДНК гепатита и генотипы

При исследовании 88 пациентов, не получавших лечение, наблюдалось варьирование концентрации ДНК вирусов в следующих приделах от 1.2 х 103 до 6.3 х 108 копий/мл (в среднем, 2.4 х 107 копий/мл). Для 80 пациентов на стадии вирусного прорыва - от 2.6 х 103 до 1.6 х 108 копий/мл (в среднем, 2.5 х 105 копий/мл). Вирусная нагрузка в образцах плазмы пациентов, не получавших лечение, была значительно выше, чем в образцах пациентов на стадии вирусного прорыва (Р <0,001, U-тест Манна-Уитни). Секвенирование 32 образцов сыворотки крови пациентов, не получавших лечение, на капиллярном секвенаторе показало следующие результаты по генотипам: генотип B у 23 пациентов (71,9%) и генотип С у 9 пациентов (28,1%). Секвенирование ДНК 33 образцов, взятых от пациентов на стадии вирусного прорыва, показало, что 23 пациента (69,7%) были инфицированы генотипом B и 10 пациентов (30,3%) были инфицированы генотипом С.

ПЦР и создание праймеров затравки

ПЦР-праймеры были подобраны путем усреднения и выбора оптимальных геномных последовательностей из различных генотипов HBV (см. Рис 2). В силу того, что последовательности отобранных вирусных вариантов удалость кластеризовать по двум общим для них всех регионам, была разработана двойная (дуплексная) ПЦР, позволяющая одновременно амплифицировать все отобранные варианты вируса гепатита. В дальнейшем при двойной ПЦР происходит оптимизация и увеличение копий ДНК HBV, если на реакционную лунку приходится более девяноста четырех копий вируса. Эта оптимизация позволяет проанализировать все сывороточные образцы с вирусной нагрузкой > 1 170 копий/мл сыворотки.

Для обнаружения 60 вариантов вируса гепатита проводилась реакция удлинения праймера, соответственно потребовалось 60 добавочных праймеров. Хотя технология MassARRAY Assay Design компании Sequenom позволяет разрабатывать высоко мультиплексированный анализ, нами было принято решение разработать анализ при существенно более низком уровне мультиплексирования. Это позволит в дальнейшем добавлять к панели вновь обнаруженные варианты вирусов гепатита и проводить обновления. Таким образом, мы разработали четырех мультиплексный анализ реакции удлинения праймера (12 плексов в анализе 1, 17 плексов в анализе 2, 17 плексов в анализе 3, и 14 плексов в анализе 4; см Табл. 2).


Рис. 1. Масс-спектрограмма для мультиплексного анализа добавочного праймера.
(А) Показан общий спектр мультиплекса. Интенсивность пиков в произвольных единицах. Часть общего спектра (А) увеличена, на спектре (В) показан пример определения конкретного гаплотипа (nt_367), праймер, продукты амплификации, тимин, продукты реакции удлинения; последовательность - цитозин мутация и последовательность - цитозин дикого типа.

Для компенсации разницы в интенсивности сигналов при масс-спектрометрии из-за различий в нуклеотидных последовательностях и молекулярных массах между добавочными праймерами, проводилась их коррекция по концентрации. Коррекция была сделана на основании реально полученных данных по масс-спектрам. На рис.1 показан репрезентативный масс-спектр для мультиплексного анализа такой корректировки.






Обнаружение 60 вариантов вируса гепатита

После оптимизации ПЦР и реакций удлинения праймера мы проанализировали образцы сыворотки 88 пациентов, не получавших лечение, и сыворотку 80 пациентов, находящихся на стадии вирусного прорыва. В этом исследовании полученные сигналы в масс-спектрограмме описывались в двух контекстах: сигналы, масс-пики по каждому из образцов, с указанием в процентах достоверных сигналов для каждого отдельного образца среди всех вариантов вируса. Частота сигналов каждого анализируемого вирусного варианта, для которых был получен достоверный в процентах сигнал среди всех образцов. Если нет, каких либо специальных пояснений, то сигналы масс-спектрограммы, относятся к достоверным по всем анализируемым образцам.

Для оценки эффективности проводимых исследований, мы вначале просмотрели частоту пиков по каждому из вирусных вариантов (указан как процент успешных и достоверных сигналов для отобранных образцов, тестируемых по каждому из вирусного варианта). Для тридцати двух вариантов вирусов (53,3%) получена частота сигналов > 98%. Для пятидесяти трех вариантов (88,3%) была достигнута частота сигналов > 90%. Для пятидесяти шести из 60 вирусных вариантов (93,3%) получена частота масс-пиков 80%.Таким образом, общая частота полученных масс-спектрометрических сигналов для всех вирусных вариантов во всех исследуемых образцах составила 95,3%.

Рис. 2. Сигналы по каждому из вариантов вирусов и частоты сигналов по каждому анализируемому образцу.
(A). Сигналы по каждому вирусному варианту по каждой группе (пациенты, не получавшие лечения - ○, пациенты на стадии вирусного прорыва - x). У большинства из вирусных вариантов отмечалась более высокая частота сигналов (у 88,3% вирусных вариантов частота сигналов достигала >90%).
(B). Сигналы для каждого образца (по оси X показана вирусная нагрузка для данного образца). Образцы от пациентов на стадии вирусного прорыва, скорее всего, имеют более низкие сигналы. Все образцы с сигналами < 90% были получены от пациентов находящихся на стадии вирусного прорыва.

Сигналы для каждого из 60 вариантов по двум группам пациентов (пациенты, не получавшие лечения, и пациенты на стадии вирусного прорыва) приведены на рисунке 2А. Общая частота полученных масс-спектрометрических сигналов по всем вариантам вирусов для образцов составила 97.0% и 93.4% соответственно. Кроме того, частота сигналов 14 вирусных вариантов, полученных из образцов пациентов с вирусным прорывом, была значительно ниже (Р < 0,05 для каждого из 14 вирусных вариантов, согласно тесту хи-квадрат Пирсона, степеней свободы =1), чем у пациентов, не получавших лечение. Более высокие сигналы, для образцов пациентов, не получавших лечение, можно объяснить высокой вирусной нагрузкой в образцах (диапазон от 1,2 х 103 до 6,3 х 108 копий/мл, среднее значение 2,4 х 107 копий/мл), чем у пациентов на стадии вирусного прорыва (диапазон от 2,6 х 103 до 1,6 х 108 копий/мл, среднее значение 2,5 х 105 копий/мл).


Были также проанализированы сигналы каждого из образцов (определялся процент успешных, достоверных сигналов для всех 60 вариантов, тестируемых в каждом образце). На рис 2В показаны сигналы для каждого образца (вирусная нагрузка по гепатиту показана по оси Х) для 2 групп пациентов. Сигналы для большинства образцов выше (>90%,) чем средние величины для пациентов, не получавших лечение. У пациентов на стадии вирусного прорыва наблюдаются более низкие значения сигналов на масс-спектрограммах (7 пациентов с частотой сигналов 80% -90% и 4 пациента с частотой сигналов < 80%).

Валидация с помощью капиллярного секвенирования

Для осуществления проверки данных, полученных с помощью системы генетического анализа MALDI-TOF MS Sequenom, мы применили метод капиллярного секвенирования. В случайном порядке был произведен отбор 70 образцов плазмы крови, 35 образцов у пациентов, не получавших лечение, и 35 образцов у пациентов, находящихся на стадии вирусного прорыва. Были использованы те же продукты ПЦР, что и для анализа на генетическом анализаторе. Последовательности обратной транскриптазы, взятые от 27 пациентов, не получавших лечение, и от 33 пациентов, находящихся на стадии вирусного прорыва, были успешно секционированы. Были успешно секвенированы последовательности малого промотора и основного промотора из 29 образцов пациентов, не получавших лечение, и 33 пациентов на стадии вирусного прорыва. Успешность секвенирования составила 87%, анализ образцов с помощью системы генетического анализа MALDI-TOF MS Sequenom был успешен на 100%.

За исключением некоторых недостоверных сигналов для вполне известных вирусных вариантов в некоторых образцах, в общей сложности были получены сигналы по 3 380 вирусным вариантам. Сигналы были получены как на геномном времяпролетном масс-спектрометре Sequenom, так и на капиллярном секвенаторе. В целом, результаты Sequenom и капиллярного секвенатора совпадали по 3 340 вирусным вариантам, что составляет 98.8%. Результаты не зависели от того, присутствовали ли в образцах вирусы дикого типа и мутировавшие формы совместно или по отдельности. Для 23 исследуемых вирусных вариантов сигналы составили 0,7%, геномный времяпролетный масс-спектрометр Sequenom одновременно обнаруживал как дикий тип, так и мутировавшую форму. Секвенатор обнаруживал только один из типов. Один из характерных примеров показан на рисунке 3А. По эти сигналам нельзя исключить пропуски небольших последовательностей (дикого типа или мутантов) из-за гораздо более низкой частоты встречаемости редких форм (20%). Некоторые из таких случаев были в дальнейшем валидированы с помощью последующего клонирования и секвенирования (данные не приводятся). В 12 случаях (0,4% от всех образцов) капиллярный секвенатор распознавал сигнал без дифференцирования на дикий и мутантный тип. Геномный масс-спектрометр распознавал эти сигналы по отдельности. Большинство из этих сигналов были низкого качества, поэтому было сложно обнаруживать незначительные вирусные варианты (см. рис. 3B). Для 0,1% сигналов (5 из 3 380 сигналов) данные по последовательности капиллярного секвенатора и данные масс-спектрометрии полностью расходились.

Обсуждение

Вирусные варианты могут возникнуть спонтанно или под действием селективных факторов. Как правило, они имеют большую биологическую и клиническую значимость. На сегодня существует множество доступных методов для высокопараллельного обнаружения вирусных мутантов. Например, для обнаружения нескольких человеческих вирусов были использованы микрочипы (13), были разработаны мультиплексные ПЦР для обнаружения вирусов гепатита генотипов A-G с точностью >93% (14). Те же микрочипы MALDI-TOF MS Sequenom были использованы для количественного обнаружения редко встречающихся вирусных вариантов (9, 11) и смешанной аллельной экспрессии (15).

В настоящем исследовании нами разработана и валидирована высоко-пропускная платформа для мультиплексной детекции 60 функционально известных или часто встречающихся вариантов вируса гепатита (HBV) с пределом обнаружения, около 1 000 HBV копий/мл сыворотки. Эта платформа существует на базе автоматизированной системы MALDI-TOF MS, которая способна производить анализ двух 384-луночных микрочипов (достаточно для 192 образцов) за один запуск. Мы целенаправленно разработали панель с уровнем мультиплексирования ниже, чем возможности iPLEX, чтобы сохранить возможность расширения платформы и включения вновь обнаруженных вариантов вирусов гепатита. Стоимость проведения анализ всех 60 вариантов вируса (за исключением расходов по сбору крови и выделению ДНК) составляет $10.

При прямом секвенировании и анализе на времяпролетном геномном анализаторе Sequenom полученные данные практически полностью совпадают. При сопоставлении результатов разных видов анализа кардинально различаются только 5 из 3 380 сигналов. Масс-спектрометр обладает большей чувствительностью, способен одновременно определять как последовательности дикого типа, так и мутации, что недоступно для метода прямого секвенирования. Следует отметить, что практически все сигналы по гетерозиготным аллелям, полученные при прямом секвенировании, были распознаны и обработаны «вручную», путем тщательного просмотра последовательностей группой исследователей. Практически все сигналы (гомозиготные или гетерозиготные), полученные с помощью масс-спектрометра, были обработаны автоматически с помощью программного обеспечения. В 13% случаев амплификация и чтение последовательностей при прямом секвенировании были неудачными, эти же локусы были успешно амплифицированы и прочитаны с помощью масс-спектрометра Sequenom.

Платформа Sequenom имеет некоторые особенности. Во-первых, были исследованы только генотипы B и C вируса гепатита (HBV), потому что эти два генотипа HBV являются наиболее распространенными в южной части Китая (16). Для получения данных о производительности данного теста при работе с другими генотипами HBV требуется дальнейшее исследование. Во-вторых, 4 из 60 вариантов вирусов имели частоту сигналов <80%, что стало основной причиной в отсутствии сигналов в 4,7% случаев. В данный момент функциональные особенности этих четырех вариантов неизвестны. В-третьих, имела место неравноценность образцов, взятых от пациентов находящихся на стадии вирусного прорыва, потому что все одиннадцать образцов были с частотой сигналов <90%, таких показателей у образцов пациентов, не получавших лечение, не было. Возможно, именно поэтому были получены данные по общей низкой вирусной нагрузки для образцов пациентов на стадии вирусного прорыва. Можно предположить, что эта стадия связана со спонтанными мутациями в геноме вируса HBV, что обуславливает невозможность присоединения добавочного праймера с ДНК вируса.

Список использованной литературы:



Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных