В НАЛИЧИЕ НА СКЛАДЕ КАТАЛОГ


Комплексная идентификация видов и родов Mycobacterium tuberculosis с применением технологии iPLEX Gold


Матрично-активированная десорбционная ионизационная лазерная времяпролетная масс-спектрометрия как основа для проведения анализов по генотипированию одиночных нуклеотидных полиморфизмов с применением технологии iPLEX Gold для комплексной идентификации видов и родов Mycobacterium tuberculosis

C. Bouakaze, 1* C. Keyser, 1,2 A. Gonzalez, 1 W. Sougakoff, 3,4 N. Veziris, 3,4 H. Dabernat, 2 B. Jaulhac, 1,5 and B. Ludes1,2,5

1EA4438 Physiopathologie et Médecine Translationnelle, Faculté de Médecine, Université de Strasbourg, Strasbourg, France

2Laboratoire d'Anthropologie Moléculaire et Imagerie de Synthèse (AMIS), CNRS/UMR5288, Université Paul Sabatier de Toulouse, Toulouse, France

3Laboratoire de Bactériologie-Hygiène, ER5 (EA1541), UPMC, Université Paris 06, Paris, France

4Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA), AP-HP, Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris, France

5Hôpitaux Universitaires de Strasbourg (HUS), Strasbourg, France

*Corresponding author. Mailing address: Institut de Médecine Légale, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France. Phone: 33 0 3 68 85 33 40. Fax: 33 0 3 68 85 33 62. E-mail: caroline.bouakaze@etu.unistra.fr

Received 14 April 2011/Returned for modification 20 May 2011/Accepted 28 June 2011

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3165613/

Основной целью настоящего исследования является изучение потенциального применения недавно обнаруженных с помощью технологии генотипирования iPlex Gold (Sequenom*) 16-ти SNP-маркеров для идентификации Mycobacterium tuberculosis и классификация изолятов по различным генетическим линиях (основные генетические группы (PGSs), так и в SNP-специфичных кластерных группах (SCGs). Маркеры были валидированы и подтверждены как достоверные. Исследователями разработан специальный 16-типлексный анализ. Основой анализа является ПЦР аллель специфичного праймера в реакции удлинения на один нуклеотид (используется набор реагентов iPLEX Gold компании Sequenom) с последующим анализом продуктов амплификации на платформе матрично-активированной десорбционной ионизационной лазерной времяпролетной масс-спектрометрии MassARRAY 4.

Разработанный исследователями анализ был протестирован на панели, состоящий из 55 изученных штаммов, которые ранее были генотипированы по тем же локусам с использованием минисеквенирования (анализ по коротким ДНК фрагментам), а также из 10 нетуберкулезных микобактерий (НТМ) и из 4 бактерий, не принадлежащих к роду Mycobacterium. Все образцы микроорганизмов были успешно проанализированы с помощью протокола исследования iPLEX. Были получены четкие данные по аллелям с достоверностью данных 99,9% (для 879 из 880 SNP). Ложноположительные результаты отсутствовали. Разработанный исследователями новый метод 16-плексного анализа iPLEX был сравнен с методом минисеквенирования, показана полная конгруэнтность двух методов, что, безусловно, позволяет осуществлять надежное распознавание видов MTBC и проводить штаммовую дискриминацию, и что самым наглядным образом демонстрирует потенциальную значимость данного метода в области инфекционной диагностики, эпидемиологии и научных исследований. По сравнению с минисеквенированием, технология iPLEX предлагает более высокую пропускную способность и является более гибким и экономически выгодным методом для микробиологических лабораторий.

Комплекс микобактерий туберкулеза (MTBC) состоит из возбудителей туберкулеза, болезни, которая до сих пор остается главной причиной заболеваемости и смертности людей во всем мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения каждый год умирает примерно 2 млн. людей (Отчет ВОЗ 2010 http://www.who.int/tb/publications/factsheets/en/). Этот комплекс состоит из восьми близкородственных видов бактерий со специфичным по отношению к человеку-хозяину тропизмом. В число патогенов входят микобактерии туберкулеза, такие как M.tuberculosis, М. africanum, М. canettii, и возбудители, которые приспособились к животным-хозяевам, такие как M. bovis, M. microti, M. caprae, M. pinnipedii и недавно идентифицированных видов М. mungia (1, 8, 12, 37). Хотя M. tuberculosis безусловно является основной причиной возникновения туберкулеза у человека, каждый микроорганизм, входящий в комплекс микобактерий туберкулеза, также вовлечен в распространение инфекции, кроме M. mungi (8, 26). Более того, два микроорганизма, входящие в этот комплекс, M. bovis и M. canettii, являются возбудителями природно-очагового туберкулеза у крупного рогатого скота. Этот довольно необычный возбудитель является причиной некоторого числа зарегистрированных в Африке случаев туберкулеза и обладает естественной резистентностью к пиразинамиду, противотуберкулезному препарату первой линии (18, 34). Таким образом, быстрое и надежное определение MTBC-изолятов на видовом уровне имеет первостепенное значение для своевременного и адекватного выбора лечения пациента противотуберкулезными препаратами, а также для осуществления мероприятий противоэпидемического характера (36).

Кроме того, недавние исследования позволили идентифицировать различные филогенетические группы микобактрий (MTBC), адаптированных к человеку как хозяину (например, M. tuberculosis и виды M. africanum), все они были конгруэнтны (2, 5, 10, 14-16, 19, 20, 32). Как показано в таблице 1, микроорганизмы комплекса MTBC в настоящее время классифицируются по шести основным филогенетическим линиям, две из которых представлены штаммами M. africanum. Эти шесть основных линий были впервые идентифицированы с помощью анализа геномных делеций или больших (длинных) полиморфных последовательностей (LSP). Методики очень схожи с методиками идентификации по отдельным нуклеотидным полиморфизмам (SNP), таким как идентификация по основным генетическим группам (PGGs),. (37), и идентификация по SNP кластерным группам (SCGs). (14). Некоторые из традиционных подходов, например, сполиготипирование, также коррелируют с данными методами (9). Данные линии ассоциированы с конкретными географическими регионами и демонстрируют различия по иммуногенетике, вирулентности и, возможно, по восприимчивости к лекарственным препаратам (7, 16, 21, 32, 37). Таким образом, возможность идентифицировать линии микроорганизмов комплекса MTBC является важным шагом для решения вопросов эволюции и источником ценной информации для борьбы с туберкулезом (3).

Таб. 1 Главные филогенетические линии микроорганизмов комплекса MTBC адаптированных к человеку
Линия
(Штамм)
Виды комплекса MTBC Наличие/отсутствие
TbD1
Номенклатура Gagneux (на основе LSP) PGG
(на базе SNP)
SCG
(на базе SNP)
Spoligotype-defined families
1 M. tuberculosis Наличие Индо-океанических линия 1b 1 EAI
2 M. tuberculosis Отсутствие Восточно-Азиатская линия 1b 2 Beijing
3 M. tuberculosis Отсутствие Восточная Африкано-Индианская линия 1b 3a CAS
4 M. tuberculosis Отсутствие Европейско-Американская линия 2, 3 3b, 3c, 4, 5, 6a, 6b H, LAM, X, T, S, и другие
5 M. africanum Наличие Западно-Африканская линия I 1b Нет данных AFRI2
6 M. africanum Наличие Западно-Африканская линия II 1a Нет данных AFRI1

a TbD1, M. tuberculosis-specific deletion region 1 described by Brosch et al. (8); PGGs are as defined by Sreevatsan et al. (37); SCG subgroups are as defined by Filliol et al. (14) and Alland et al. (2); EAI, East African-Indian family; CAS, Central Asian family; H, Haarlem family; LAM, Latin American-Mediterranean family.

В последнее десятилетие появился ряд методов на основе ПЦР, с помощью которых удалось разработать методику дифференциации видов MTBC. Эта методика может заменить существующие трудоемкие фенотипические и биохимические анализы бактериальных культур, ранее считавшиеся «золотым стандартом» (4, 17, 23, 25, 27, 28, 30, 38). Все эти методы на основе ПЦР, в том числе и коммерческий «GenoType» для анализа изолятов комплекса MTBC (Hain Lifescience), основаны на распознавании видоспецифичных полиморфизмов. Как правило, это SNP и/или LSP или регионы делеций [RDs]. Недавно был описан метод с использованием секвенирования точного тандемного повтора D (ETR-D), включающий определение: (i) переменного числа копий (от 1 до 7 копий) в данном повторе, (ii) 6-ти маркерных SNP и (iii) двух делеций/инсерций(13). Тем не менее, хотя и LSP и SNP являются идеальными маркерами для осуществления классификации по филогенетическим группам MTBC, ни один из вышеуказанных методов не позволяет осуществить окончательную идентификацию изолятов на уровне вида/штамма и их одновременную классификацию (11, 16).

Нами недавно была опубликована статья о разработке инновационной двухступенчатой стратегии по обнаружению 16-ти мишеней, SNP маркеров для идентификации изолятов комплекса MTBC до вида. Мы использовали восьми плексные анализы на основе технологии моментальных снимков (SNaPshot technology, ТМС) компании Applied Biosystems [AB] (6). Как показано на рис. 1, эта технология SNP-генотипирования включает в себя аллель-специфичное удлинение праймера с использованием флуоресцентных терминаторов с последующей детекцией методом капиллярного электрофореза. Первый восьмиплексный анализ ТМС позволяет осуществить распознавание трех PGG (37) и надежно идентифицировать микроорганизмы комплекса MTBC (кроме PGG-1b М. tuberculosis и PGG-1b M. africanum и М. mungia). Второй восьмиплексный анализ ТМС позволяет осуществить дальнейшее распределение изолятов M. tuberculosis в одну из шести SCGs и пять подгрупп по классификации Филиола и др. (14). Таким образом, уникальной особенностью этой двухступенчатой стратегии является возможность одновременно идентифицировать микобактерии комплекса MTBC и их штаммы (линии), используя комбинацию из двух плексных анализов.

Рис. 1. Принцип анализа SNP с помощью двух независимых технологий по SNP генотипированию: технологии моментальных снимков (Applied Biosystems) и технологии iPLEX (Sequenom). Метод генотипирования состоит из трех основных этапов, а именно: ПЦР фрагмента ДНК, содержащего SNP (шаг 1), реакции аллельной дискриминации, состоящей из реакции удлинения на один нуклеотид (SBE) (шаг 2), и детекции продуктов аллель-специфической реакции (шаг 3).

В последние годы стали доступны многие технологии для SNP - генотипирования, включая полностью интегрированные коммерческие решения (29, 31, 35). Каждая система детекции, состоящая из биохимических наборов и аналитических платформ, обладает своими особенностями и имеет уникальную комбинацию пропускной способности образцов, возможности мультиплексирования и себестоимость. В настоящем исследовании мы провели анализ потенциального использования новой технологии SNP-генотипирования на основе коммерчески доступной платформы MassARRAY Sequenom Inc. (Сан-Диего, Калифорния) для одновременного анализа 16-ти SNP. Эти маркеры, как уже было упомянуто, были выбраны для идентификации видов и штаммов комплекса MTBC с использованием технологии моментальных снимков (6). Как и ТМС (Snapshot), недавно появившаяся технология iPLEX Gold (Sequenom) основана на реакции удлинения праймера на один нуклеотид для последующей аллельной дискриминации. В отличие от первой технологии, в iPLEX Gold используются модифицированные по массе терминаторы без флуоресцентных меток. Продукты удлинения матрицы (SBE) распознаются с помощью матрично-активированной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), как показано на рис. 1.

Таблица 2. Основные данные об анализируемых SNP в данной публикации

а. Два SNP в положении 144390 и 2460626 при наличии аллеля “A” характеризуют M. Tuberculosis, относящиеся к SCG-4.
b. Положения и аллели указаны относительно «+»- цепи штамма H37Rv M. tuberculosis последовательности генома (NC_000962.2).

Таким образом, технология iPLEX Gold сочетает в себе преимущество надежности реакции удлинения праймера (SBE) с чувствительностью, быстротой и точностью обнаружения времяпролетной масс-спектрометрии. Таким образом, разработанный шестнадцатиплексный анализ iPLEX был оценен по сравнению с ранее разработанной технологией моментального снимка, показано, что метод позволяет осуществлять одновременный анализ 16-ти SNP в одном 16-типлексном анализе моментального снимка.

Материалы и методы

Образцы микобактерий. В настоящем исследовании использованы образцы ДНК MTBC, которые были проанализированы в предыдущих работах (6). Для исследования было отобрано 55 образцов ДНК, полученных из эталонных штаммов микобактерий туберкулеза H37Rv АТСС 27294, M. bovis CIP 102426, М. bovis BCG CIP 105226 и клинических изолятов микобактерий туберкулеза (34), М. bovis (6) М. bovis BCG (4), М. africanum (4), М. canettii (1), М. caprae (1), М. microti (1) и М pinnipedii (1). Изоляты были идентифицированы до вида с помощью фенотипических и биохимических методов и/или путем генетического анализа, для некоторых из образцов использовался VNTR - типирование, как было описано выше. (6). В общей сложности 37 из этих образцов (M. tuberculosis H37Rv и М. Bovis CIP 102426, один клинический изолят М. africanum и все остальные клинические изоляты M. tuberculosis) ранее были успешно использованы для генотипирования 16 SNP локусов в этом исследовании. Все остальные изоляты были успешно генотипированы по 8 локусам SNP. Также в настоящем исследовании были использованы в качестве отрицательного контроля образцы 10 ДНК микобактерий, не принадлежащих к комплексу MTBC, в том числе М. fortuitum (1), М. kansasii (2), М. abscessus (1), М. avium (3), М. chelonae (2), М. gordonae (1) и 4 бактерии, которые не принадлежат к роду Mycobacterium (Nocardia nova, Corynebacterium amycolatum, Staphylococcus aureus и Escherichia coli).

SNP панель. Для настоящего исследования была разработана специальная панель, в основу которой положен таргетный принцип по 16 филогенетически соответствующим мишеням для комплекса MTBC, данные были валидированы по соответствию как виду, так и штамму (6). Общая информация по полиморфизмам приведена в таблице 2.

Следует отметить, что по техническим причинам SNP в положении 2460628 (что соответствует позиции 2460626 в работе Филиола и др. [14]), анализируемое на 16 плексах методом моментальных снимков (SNaPshot) было заменено на SNP в положении 144390 для 16 плексного анализа (нумерация в соответствии с H37Rv M. tuberculosis NC_000962.2). Эти два полиморфизма маркированы как штамм SCG-4 M. tuberculosis и филогенетически совпадают (2, 14).

Модифицированный 16 плексный анализ методом мгновенных снимков (SNaPshot)

Для того чтобы получить наиболее достоверное сравнение технологии моментальных снимков (SNaPshot) и технологии iPLEX, мы объединили два 8 плексных анализа ТМС, описанных Bouakaze и др. (6), в единый 16 плексный анализ, что позволило одновременно осуществлять анализ интересующих 16 SNP. В первую очередь были протестированы праймеры, прямой, обратный и добавочный (SBE), без модификации этих праймеров в формате единого 16 плексного анализа ТМС, с 1 нг ДНК. В качестве матрицы использовался штамм H37Rv M. tuberculosis. Эксперимент полностью соответствовал методике, за исключение того, что капиллярный электрофорез проводился на генетическом анализаторе ABI 3500 (АВ, Фостер Сити, Калифорния), и автоматическая обработка сигналов по аллелям была выполнена с использованием программного обеспечения (AB) GeneMapper четвертой версии (6). Тем не менее, для того чтобы получить автоматизированный сигнал от всех 16 SNP, пришлось изменить последовательности трех добавочных праймеров, увеличивая или уменьшая размер их 5-‘ концов таким образом, чтобы пик для каждого продукта удлинения, полученного при амплификации добавочного праймера, был легко различим на электрофореграмме. Размеры добавочных праймеров (SBE) по SNP локусам 2460628 и 105139 были увеличены до 65 нуклеотидов вместо 55 нуклеотидов, и до 52 нуклеотидов вместо 50-ти, соответственно. Размер добавочного праймера для SNP локуса gyrB (675) был уменьшен с 64 до 52 нуклеотидов. Все 55 образцов комплекса MTBC были повторно проанализированы по этим 16 локусам с использованием 16 плексного анализа ТМС и новых модифицированных праймеров.

Новый 16 плексный анализ

Прямые, обратные и добавочные праймеры для каждого SNP были разработаны с использованием программного обеспечения MassARRAY, версия 4.0 (Sequenom Inc., San Diego, CA), за исключением праймеров для SNP локусов hsp65631 и 144390. В этих случаях праймеры были разработаны с использованием программного обеспечения Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Был установлен оптимальный размер ампликона порядка 80-120 п.о. Специальная метка, состоящая из десяти нуклеотидов (5’-ACGTTGGATG-3’) добавлялась к 5-‘ концу каждого ПЦР-праймера. Дабы избежать путаницы при чтении масс-спектров, к добавочному праймеру (SBE) с 5-‘ конца добавлялись негомологичные последовательности различной длины, которые создавали достаточно большую разницу в массах продуктов реакции удлинения праймера (SBE), что позволяет осуществлять последующую детекцию с помощью MALDI-TOF MS. Последовательности праймеров ПЦР, прямого, обратного и добавочного, приведены в таблице 3.

Таблица 3. Структуры прямых, обратных и добавочных праймеров (SBE), используемые в этом исследовании для анализа 16 плексной панели iPLEX

Анализ по SNP - генотипированию был проведен в соответствии с рекомендациями производителя набора реагентов iPLEX Gold компании Sequenom и инструкциями для программного обеспечения и оборудования на базе платформы MassARRAY 4. Последовательности с 16 мишенями были одновременно амплифицированы в 5 мкл конечного объема ПЦР, состоящей из ПЦР-буфера, 2 мМ MgCl2, 500мкM дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), 0,1 мкл каждого из ПЦР праймеров, 0,5 ед Taq-полимеразы (HotStar) и 3,4 мкл экстракта бактериальной ДНК. Процесс термического циклирования состоял из стадии денатурации при 95°С в течение 2 мин с последующими 45 циклами денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и элонгации при 72°С в течение 1 мин и заключительной стадии элонгации при 72°С в течение 5 мин. Для нейтрализации не присоединившихся дНТФ ПЦР-продукты обрабатывали 0,5 U щелочной фосфатазы при 37°С в течение 40 мин с последующей инактивацией фермента при 85°С в течение 5 минут. Затем в очищенную амплификационную смесь добавляли 2 мкл смеси SBE, итоговый объем 16 плексной смеси SBE составлял 9 мкл и содержал буфер 0,222x iPLEX, смесь терминации iPLEX, фермент iPLEX и смесь праймеров SBE (16 SBE праймеры, разделенные на 4 группы по массе). В конечной реакции SBE концентрация смеси праймеров с низкой массой составляла 7 мкМ, концентрация смеси, состоящей из двух праймеров со средней молекулярной массой, 9,3 мкМ и 11,6 мкМ, а концентрация праймеров с высокой массой - 14 мкМ. Реакцию удлинения iPLEX проводили при следующих температурных режимах начальная стадия денатурации при 94°С в течение 30 с с последующими 40 циклами при 94°С в течение 5 с, 5 циклами отжига при 52°C в течении 5 с и элонгации при 80°С в течение 5 с и конечной стадии элонгации при +72°С в течение 3 мин. После обессоливания продуктов амплификации с помощью катионообменной смолы SpectroCLEAN (по протоколам производителя) очищенные продукты удлинения праймера были нанесены на спектральный 96-тилуночный чип SpectroCHIP с использованием нанодиспенсера RS1000. Чип анализировали на масс-спектрометре MassARRAY Compact 96. Спектры были получены с использованием программного обеспечения SpectroAcquire, анализа данных, включая анализ сигналов по аллелям, был сделан с помощью программного обеспечения MassARRAY Typer, версия 4.0.5. Для каждого из исследуемых образцов эксперимент был выполнен минимум в двух повторах.

Секвенирование ДНК

Маркеры, которые не могут быть обнаружены с помощью 16 плексного анализа ТМС и/или 16-плексной iPLEX панели, были амплифицированы в формате единичного плекса, используя пару праймеров ТМС, как было описано ранее (6). После визуальной оценки продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле, проводилось стандартное секвенирование с обоих праймеров с помощью набора BigDye Terminator (версия 3.1) в соответствии с рекомендациями производителя. Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI 3500 (AB), обработка и редактирование полученных данных были выполнены с использованием программного обеспечения Sequencher, версия 4.7 (Корпорация Gene Codes., Анн-Арбор, Мичиган).

Результаты

16 SNP, взятые в качестве маркеров в двух 8 плексных анализах технологии моментальных снимков для идентификации M. tuberculosis комплекса видов и штаммов (6), были успешно проанализированы с помощью модифицированного 16 плексного анализа ТМС. Были протестированы 55 образцов MTBC комплекса с помощью единого формата 16 плексного анализа ТМС. Аллельные данные в полном объеме совпадали с данными, полученными ранее с двумя 8 плексными анализами ТМС. По трем локусам (gyrA95, 1977 и 105139) образца M. сanettii амплификация, несмотря на ожидаемый положительный результат, не удалась. Таким образом, были проаннотированы 877 аллеля из ожидаемых 880, результирующее значение по сигналам анализируемых аллелей 99,7%. Отрицательный контроль осуществлялся с практически во всех SNP локусах (кроме локусов hsp65631, 16S rRNA1249 и 232574), также как уже описывалось для двух 8 плексных анализов ТМС (6).

Для сравнения новая 16 плексная панель iPLEX была протестирована с тем же самым набором образцов (55 видов MTBC комплекса). Результатом данного теста являлось получение сигналов по 879 аллелям, результирующее значение по сигналам анализируемых аллелей 99,7%. Совпадения по аллелям, которые были продублированы 16 плексной панелью iPLEX и анализом ТМС, составило 100%. Единственный аллель, который не был определен даже после проверки вручную, расположен в позиции SNP 105139 у образца М. canettii. Результаты генотипирования, полученные по технологии iPLEX, для 55 анализируемых в этом исследовании образцов, а также данные по PGGs и SCGs по этим генотипам, представлены в таблице 4. Все исследуемые виды комплекса MTBC были четко дифференцированы по крайней мере по одному локусу, за исключением одного штамма M. africanum и двух штаммов M. tuberculosis, что показывает схожую комбинацию аллелей и то, что они были кластеризованы в одной и той же группе (PGG-1b/SCG-1). Таким образом, 16 плексная iPLEX панель для анализов, разработанная в данном исследовании, подходит для идентификации видов комплекса MTBC, за исключением некоторых штаммов PGG-1b М. africanum, штамма PGG-1b M. tuberculosis и М. mungi. Предлагаемый анализ обладает потенциалом для идентификации основных микобактерий MTBC комплекса, так как результаты, полученные по видоспецифичным маркерам в процессе генотипирования, позволили однозначно классифицировать все 55 образцов комплекса MTBC по принадлежности к PGG и SCG полиморфизму, филогенетических несоответствий не наблюдались. Следует отметить, что непредвиденные пики были замечены для полиморфизмов в некоторых образцах (отрицательный контроль), такие пики систематически наблюдаются даже в образцах с водой и не мешают интерпретировать полученные данные.

Таблица 4. Результаты генотипирования, полученные с использованием iPLEX, для 55 анализируемых образцов и данные по PGGs и SCGS по этим генотипам.

На рисунке 2 показаны примеры данных по электрофореграмме и масс-спектрометрии, полученных для контрольных штаммов H37Rv M. tuberculosis и М. Bovis CIP 102426 с использованием 16 плесного анализа ТМС и 16 плексного iPLEX анализа, соответственно. По этим двум анализируемым видам были получены отличающиеся друг от друга данные по электрофореграмме и масс-спектрометрии. Тем не менее, данные, полученные по результатам генотипирования по этим двум разным технологиям SNP анализа, согласовывались и с литературными данными (14, 37).

a. изоляты MTBC были отнесены к одной из трех PGG описанных Sreevatsan и др. (37), по аллельным комбинациям в трех локусах (katG463, gyrA95, и katG203).

b. изоляты MTBC были отнесены к одной из семи SCGS, описанных Filliol и др. (14), по аллельным комбинациям в 9 локусах (полиморфизмы отмечены звездочкой).

Рис. 2. H37Rv М. tuberculosis и М. bovis CIP102426, электрофореграммы и масс-спектрограмма получены с использованием 16 плексного анализа ТМС и 16 плексного анализа iPLEX, соответственно. Электрофореграммы (Aa и Ba) были получены с помощью программного обеспечения (AB) GeneMapper (версия 4). Показаны относительные единицы флуоресценции (RFU) по сравнению со стандартными размерами (нуклеотидов), продукты удлинения матрицы (SBE) приведены к стандарту внутреннего размера GeneScan-120 LIZ (AB). Масс-спектры (Ab и Bb) были получены с использованием программного обеспечения MassARRAY Typer (версия 4.0.5), (Sequenom). Показана зависимость относительной интенсивности по отношению к массе. Мутантные аллели указаны стрелками.

Действительно, для образца H37Rv M. tuberculosis всегда наблюдались комбинации в полиморфизмах PGG-3 (то есть, CTG → CGG на katG кодона 463 и ACC → AGC в GyrA кодона 95) и SCG-6B (1977G → А, 3352932G → С и 311613T → G). Образец М. Bovis обладал полиморфизмами, связанными с PGG-1a (т.е. ACC → ACT в кодоне katG 203) и SCG-7 (74092C → Т и 913274C → G), а также мутантными аллелями в двух генах gyrB, по следующим SNP: gyrB (756G → A) и специфичных полиморфизмов gyrB для M. bovis (1410C → T).

Проксимальные области ДНК трех локусов M. canettii, которые не удалось проанализировать с помощью анализа ТМС и/или анализа панели iPLEX (т.е. 105 139, 1977 и gyrA95), были дополнительно изучены путем секвенирования. Результаты секвенирования показали, что образец М. canettii, используемый в данном исследовании, имеет вариативность в последовательности сайта связывания праймеров по трем локусам. Анализ был произведен с помощью ТМС и праймера затравки, также были использованы анализ iPLEX и праймер затравки по локусу 105139. Таким образом, ошибки, связанные с работой праймера затравки, были, скорее всего, вызваны несоответствием между мишенью и самим добавочным праймером. Хотя нам и не удалось произвести детекцию трех локусов M. canettii, в двух анализах, описанных в данном исследовании, мы легко выделили M. canettii из других видов благодаря замене С на T в локусе hsp65631. Этот полиморфизм специфичен для вида M. canettii (17).

Обсуждение

В предыдущем исследовании мы сообщали о разработке двух взаимодополняющих 8 плексных панелей (анализов) ТМС для тестирования 16 маркеров SNP, которые позволяют (I) идентифицировать микобактерии комплекса MTBC (кроме штамма PGG-1b М. africanum, штамма PGG-1b M. tuberculosis и М. mungi), (II) распознавать PGG линий, согласно Sreevatsan и др. (37) и (III) классифицировать изоляты M. tuberculosis и относить их в одну из шести SCGs линий согласно Filliol и др. (14). Данное исследование подтверждает, что одновременный анализ этих 16 SNP можно проводить с равной эффективностью и надежностью с помощью единого 16 плексного анализа ТМС в соответствии с протоколом, описанным в нашей предыдущей статье, и модификаций к нему. Таким образом, наши результаты подтверждают, что анализы ТМС по уровню мультиплексирования могут быть намного более компактными, чем рекомендовано производителем, который рекомендует исследовать не более десяти SNP в одном исследовании. Повышение уровня мультиплексирования является эффективным способом снижения себестоимости анализа, повышения пропускной способности и экономии времени. Данный подход позволит лабораториям осуществлять идентификация комплекса микроорганизмов MTBC как по признанным маркерам PGG и SCGS, так и с помощью метода на базе платформы капиллярного электрофореза.

В исследовании также описывается разработка новой 16 плексной панели iPLEX для проведения генотипирования данных видо- и штаммо- специфичных микроорганизмов с использованием коммерчески доступной платформы Sequenom MassARRAY MALDI-TOF MS. Эта 16 плексная iPLEX панель осуществляет генерацию сигналов SNP высокого уровня и показывает высокую степень воспроизводимости. Полученные данные идеально согласовываются с данными анализов 16-плексной ТМС. Таким образом, недавно разработанный анализ на 16 плексной панели iPLEX также может быть использован для достоверной идентификации видов комплекса MTBC и распознавания последовательностей PGG и SCG при культивировании штаммов комплекса MTBC.

Анализы по ТМС, так и анализ на базе панели iPLEX, описанные в данном исследовании, признаны эффективными и простыми в использовании. Полученные данные легко интерпретируются, так как сигналы аллелей автоматически обрабатываются специальной программой для анализа. Тем не менее, проведение каждого анализа имеет свою специфику, как преимущества, так и недостатки, что связано с разными подходами в технологиях SNP - генотипирования. Основным преимуществом анализов на базе ТМС является то, что они легко могут быть проведены в лабораториях, которые имеют автоматизированный секвенатор. Сейчас эти приборы очень распространены в микробиологических лабораториях. Как правило, секвенаторы используются для классического секвенирования и типирования MIRU-VNTR. Этот подход предполагает использования флуоресцентно меченых терминаторов (меток). В случае же применения технологии iPLEX флуоресцентные метки не используются. По сравнению с анализом ТМС технология iPLEX предлагает множество дополнительных преимуществ. Например, анализ MALDI-TOF MS гораздо быстрее, чем анализ с помощью капиллярного электрофореза: требуется всего несколько секунд для времяпролетного масс-спектрометра и минуты для капиллярного электрофореза. В дополнение ко всему вышесказанному следует добавить, что применение панели на базе iPLEX подходит для проведения высокопропускного, потокового анализа. В зависимости от конфигурации системы MassARRAY, предлагается 96-тилуночный формат или 384-хлуночный формат, чип является универсальным, одним и тем же. Кроме того, в недавнем исследовании было показано, что сполиготипирование микроорганизмов комплекса MTBC по анализу 43 спейсеров, найденных в DR области, может быть так же осуществлено на базе платформы MassARRAY (22). Анализ этих маркеров, который в настоящее время рутинно производится по линии обратной блот-гибридизации, весьма полезен для составления молекулярных профилей и профилей по генотипированию штаммов комплекса MTBC для последующего эпидемиологического контроля (9, 24). Таким образом, платформа MassARRAY также способна предоставить ценную информацию для молекулярного типирования штаммов комплекса MTBC. Не смотря на основной недостаток анализов на базе панелей iPLEX – необходимость приобретения специфического оборудования, инвестиции в это оборудование на базе платформы MassARRAY могут быть очень привлекательными, в первую очередь, для микробиологических центров, как со средней, так и с высокой пропускной способностью (33).

Данное исследование показало, что технология iPLEX на базе платформы MassARRAY может быть использована для точного генотипирования 16 маркерных SNP, которые позволяют одновременно осуществлять дифференциацию видов комплекса MTBC с описанием основных филогенетических линий. По сравнению с 16 плексным анализом ТМС, 16 плексная панель для анализов iPLEX может предложить более высокую пропускную способность, обеспечить большую гибкость и, безусловно, является экономически выгодным вариантом для микробиологических лабораторий. Тем не менее, данное исследование представляет собой лишь первоначальную оценку возможности использования платформы на базе MALDI-TOF MS для идентификации видов и штаммов комплекса MTBC. Требуется проведение дальнейшей оценки с более расширенной коллекцией микобактерий MTBC комплекса.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы выражаем особую благодарность Сюзане Мюллер, сотруднице компании Sequenom, (Гамбург, Германия), за техническое содействие при разработке и дизайне панели iPLEX.

* Сейчас компания Sequenom называется Agena Bioscience

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ



Связаться с нами / оформить заказ

Ваше имя *
Организация *
Контактный телефон
Контактный E-mail *
Интересующий продукт *
Сообщение
пожалуйста, заполните все поля со *

CAPTCHA Подтвердите, пожалуйста, что Вы человек:

При отправке заявки вы соглашаетесь на использование ваших персональных данных